伍蓉莉，歐陽信，段 杉*，段星星，翟苗苗，張林靜，凌曉怡，高向陽

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

魚露一般以魚、蝦等為原料，是在多種微生物共同參與下釀制而成的一種調(diào)味品[1]。魚露的發(fā)酵涉及多種微生物的作用，研究表明酵母菌和乳酸菌對其風(fēng)味有較大影響[2]，耐鹽乳酸菌是其中的優(yōu)勢菌[3]。嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）屬于乳酸菌，革蘭陽氏性球菌，四聯(lián)或成對，常存在于高鹽發(fā)酵食品中[4-5]，能在鹽濃度高達25%的條件下生長[6]。中國傳統(tǒng)露天釀造的醬油中存在嗜鹽四聯(lián)球菌，其發(fā)酵得到的醬油的安全性被廣大群眾接受。并且研究表明，將嗜鹽四聯(lián)球菌與蛋白酶結(jié)合，能提高產(chǎn)品風(fēng)味[7-8]。趙國忠等[9]在醬油釀造過程中添加耐鹽乳酸菌，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）屬乳酸菌之一，產(chǎn)L-乳酸[10]，盡管其安全性尚不明確，但由于它也是從魚露中分離出來的，并且目前不清楚它對魚露風(fēng)味有何貢獻，所以本文暫時將其與嗜鹽四聯(lián)球菌一起進行比較研究。

目前對魚露的研究集中在發(fā)酵工藝[11]、微生物動態(tài)分析[12]、耐鹽機制[13]，但是魚露中不同種的耐鹽乳酸菌發(fā)酵特性如何？同一種但不同株的耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性是否存在差異？這些問題尚不明確，有待進一步研究探討。故本研究從魚露中篩選耐鹽乳酸菌，并進一步比較不同耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性，旨在為今后將耐鹽乳酸菌應(yīng)用于魚露的發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

魚露：發(fā)酵中期的魚露，廣東省汕頭魚露廠有限公司提供；藍圓鲹（Decapterus maruadsi），又名巴浪魚：廣州市天河區(qū)長湴綜合市場。

1.1.2化學(xué)試劑

牛胰蛋白酶（250 U/mg）：廣州市天河區(qū)；酶制劑：上海源聚生物科技有限公司；復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）：廣州市天河區(qū)；酶制劑：廣州市天河區(qū)遠天酶制劑廠；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Zymo Research公司；引物：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；組胺標(biāo)準(zhǔn)品、5′-肌苷酸二鈉（5′-inosinic acid disodium salt hydrate，IMP）標(biāo)準(zhǔn)品、5′-鳥苷酸二鈉（5′-guanylicaciddisodium salthydrate，GMP）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸細菌（MRS）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T196DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴增儀：德國BIOMETRA公司；LC-10AT高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀（配SPD-10A紫外檢測器）：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的篩選

以發(fā)酵中期的魚露為原料，用20%的鹽水將魚露樣品稀釋成不同的梯度后分別涂布于用含10%NaCl、0.2%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上進行篩選。于30℃有氧培養(yǎng)5 d。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的菌落經(jīng)2～3次分離純化得到單菌落。

1.3.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將得到的單菌落進行革蘭氏染色并進行形態(tài)學(xué)觀察。

分子生物學(xué)鑒定：提取G+細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），利用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴增其16SrDNA序列。PCR擴增體系：Taq酶Mix（12.5μL）、模板DNA（2.5μL）、引物27F（1 μL）、引物1492R（1 μL）、dd H2O（8 μL）；PCR擴增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸l.5 min，72℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)為30。電泳檢測擴增結(jié)果合格后，將PCR擴增產(chǎn)物送廣州生工生物科技有限公司測序，并將測序結(jié)果在EzBicloud網(wǎng)站上與模式株比對，利用軟件MEGA 7.0中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 魚肉水解液的制備

將新鮮藍圓鲹切成小塊后打漿，以魚肉∶水∶食鹽∶復(fù)合蛋白酶=100∶50∶10∶0.1的質(zhì)量比混勻后，于60 ℃的水浴鍋中酶解5h，定期用玻璃棒攪拌。再加入0.25%胰蛋白酶（牛胰）及20%的水于37℃條件下繼續(xù)酶解4 h。酶解后先過200目篩，將濾液在4 500 r/min條件下離心10 min，再進行抽濾，得到澄清的魚蛋白水解液并測定其鹽度。再補加NaCl，使魚蛋白水解液的鹽度達到25%，然后經(jīng)121℃，滅菌20 min。

1.3.4 耐鹽乳酸菌的發(fā)酵

將從魚露里篩選的耐鹽乳酸菌先用含10%NaCl的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，再轉(zhuǎn)接至含20%NaCl的MRS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至變渾濁后進行平板計數(shù)，再分別接種到已滅菌的魚肉水解液樣品中，使接種后的魚肉水解液中乳酸菌總數(shù)大約為107CFU/mL，以不接種任何菌種的魚肉水解液為空白對照，30℃，有氧條件下培養(yǎng)60 d，分別在培養(yǎng)0、5 d、15 d、30 d、45 d、60 d取樣，每組3個平行。定期取樣，用快速濾紙過濾后得待測液，進行后續(xù)各項指標(biāo)的測定。發(fā)酵過程中定期無菌取樣測定鹽度，補加蒸發(fā)的水分以保持鹽度恒定。

1.3.5 耐鹽乳酸菌發(fā)酵性能研究

（1）pH值及總酸的測定

pH值測定采用數(shù)字式pH計測定；總酸測定參照國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[14]中的方法進行。

（2）細菌數(shù)量的測定

采用平板計數(shù)法，利用含有10%NaCl的MRS培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，計數(shù)結(jié)果單位為CFU/mL。

（3）鹽度的測定

鹽度的測定參照國標(biāo)GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》[15]中的方法進行。

（4）氨基酸態(tài)氮的測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）的測定參照國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[14]中的方法進行。

（5）揮發(fā)性鹽基氮測定

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）測定參照國標(biāo)GB5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[16]中的微量擴散法。

（6）總可溶性氮的測定

總可溶性氮（total soluble nitrogen，TSN）的測定參照國標(biāo)GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[17]中的凱氏定氮法。

（7）組胺含量的測定

樣品衍生化處理：移取5mL發(fā)酵液于50mL的離心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，均質(zhì)1 min，于3 000 r/min條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至容量瓶中，將沉淀重復(fù)提取一次。取1.0 mL提取液于5.0 mL棕色容量瓶中，依次加入2mol/L氫氧化鈉溶液100μL、飽和碳酸氫鈉溶液300μL和10 g/L丹酰氯溶液2 mL后，在40℃的條件下避光反應(yīng)45 min。反應(yīng)完畢后，加入100 μL氫氧化銨，靜置30 min，用乙腈定容到5.0 mL，振蕩混勻，取適量過0.22 μm濾膜后待測定。

組胺含量的測定采用高效液相色譜（high performanceiquid chromatography，HPLC）法[18]，其色譜條件為：DIKMA Spursil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫 35 ℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長為254 nm。流動相為水（A）和乙腈（B），采用二元高壓梯度洗脫，梯度洗脫條件：0～10 min，65%B→71%B；10～25 min，71%B→74%B；25～50 min，74%B→81%B。根據(jù)保留時間定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

（8）呈味核苷酸的測定

參照國標(biāo)GB 5413.40—2016[19]《嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》中的HPLC法進行測定。其色譜條件為：色譜柱為Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長254 nm；流動相為磷酸鹽緩沖液（1.20 mmol/L四丁基硫酸氫銨，0.01 mol/L磷酸二氫鉀）∶甲醇=1 000∶40（V/V），用磷酸調(diào)pH值至3.2，等梯度洗脫。根據(jù)保留時間定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.6 感官評定方法和標(biāo)準(zhǔn)

采用定量描述分析法（quantitative description analysis method，QDA）進行感官評定。感官評價小組由10人組成5男5女），10人經(jīng)總時間≥2 h的培訓(xùn)后，分別對魚露的色澤、透明度、氣味（酯香味、醬香味、鹵肉味、魚腥味、腐臭味）和滋味（澀味、酸味、鮮味、甜味、咸味）進行感官評價，按1～7分進行評分，“1”代表完全沒有所指的味道，“7”代表所指味道非常強烈。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

測定和分析結(jié)果采用SPSS 20.0和Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采取均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式，P＜0.05認為具有顯著差異。采用MEGA7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

通過篩選，發(fā)現(xiàn)5株菌在篩選平板上產(chǎn)生明顯的溶鈣圈，分別命名為菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)結(jié)果見圖1。由圖1可知，單菌落后經(jīng)革蘭氏染色，均呈革蘭氏陽性，細胞均呈球狀，四聯(lián)或成對。

圖1 菌落形態(tài)(A)及細胞形態(tài)(B)Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)

將這5株菌測序獲得的16S rDNA序列在EzBicloud網(wǎng)站上比對，找到與其同源性較高的模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E與Tetragenococcus halophilus的進化距離最接近，菌株JL-F與Staphylococcus epidermidis在同一分支上，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以鑒定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均為嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）；菌株JL-F為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。

圖2 5株耐鹽菌基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of five salt-tolerant bacteria

2.3 耐鹽乳酸菌的發(fā)酵性能研究

2.3.1 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中pH值及總酸的變化

耐鹽乳酸菌具有產(chǎn)乳酸的能力，從而使得魚肉水解液的pH值發(fā)生改變。因此測定了魚肉水解液中pH值，結(jié)果見圖3。

圖3 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中pH變化Fig.3 Changes of pH value during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，魚肉水解液中的pH值先下降后趨于平緩。發(fā)酵15 d后菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的pH值分別穩(wěn)定在4.35、4.90、4.33、4.60、5.40。經(jīng)SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵得到的魚肉水解液的pH值在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。對照組的pH值基本保持穩(wěn)定（pH 5.65）。

魚肉水解液中總酸的測定結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中總酸的含量呈現(xiàn)逐漸上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，總酸含量最高可達27.28mmol/100mL，而對照組的總酸一直穩(wěn)定在8.00 mmol/100 mL。說明耐鹽乳酸菌的代謝活動使得發(fā)酵液中的總酸含量增加。經(jīng)SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解液的總酸值不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

圖4 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.4 Changes of total acid contents during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.2 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中菌落數(shù)的變化

魚肉水解液中耐鹽乳酸菌數(shù)量的測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵過程中，對照組中細菌數(shù)量始終為零，而5株耐鹽乳酸菌的數(shù)量均呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。這與UDOMSIL N等[20]將嗜鹽四聯(lián)球菌接種至魚露中，提升其產(chǎn)品風(fēng)味的研究中測得的細菌數(shù)量變化趨勢一致。發(fā)酵后期，細菌數(shù)量急劇下降。分析原因可能是：一方面因為魚肉水解液中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗，導(dǎo)致營養(yǎng)匱乏；另一方面菌體本身生長代謝過程中產(chǎn)生的某些次級代謝產(chǎn)物不利于其生長。經(jīng)SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解的菌落數(shù)在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

圖5 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中菌落總數(shù)的變化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colonies during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.3 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中AAN、TVBN及TSN的變化

魚肉水解液中接種不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵后AAN、TVBN、及TSN變化趨勢分別見圖6。

圖6 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中ANN(A)、TVBN(B)及TSN(C)含量變化Fig.6 Changes of ANN(A),TVBN(B)and TSN(C)contents during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由圖6A可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中AAN的含量呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，而對照組的AAN含量在0.20 g/100 mL上下波動。不同菌株發(fā)酵液中AAN的含量呈現(xiàn)的趨勢基本一致。經(jīng)SPSS分析，不同菌株發(fā)酵的魚肉蛋白水解的AAN含量在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖6B可知，隨著發(fā)酵時間的延長魚肉水解液中揮發(fā)性鹽基氮的含量逐漸上升，且接種表皮葡萄球菌JL-F的魚肉水解液發(fā)酵至60d時，TVBN含量升至155.31mg/100mL。而對照組雖未接種菌種，但其TVBN含量也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，分析原因可能是魚肉水解液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致。經(jīng)SPSS分析，不同菌株發(fā)酵的魚肉蛋白水解的TVBN值在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖6C可知，接種不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中TSN含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。而對照組的TSN含量基本穩(wěn)定在11.3 g/100 mL。經(jīng)SPSS分析，嗜鹽四聯(lián)球菌JL-B、JL-C、JL-D、JL-E發(fā)酵的魚肉蛋白水解的TSN值在不同時間點均無顯著差異（P＞0.05），但4株嗜鹽四聯(lián)球菌與表皮葡萄球菌JL-F均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.3.4 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中呈味核苷酸檢測結(jié)果

核苷酸對魚貝類的風(fēng)味有一定的影響，通常認為5′-肌苷酸二鈉（inosine-5'-monophosphate，IMP）和5′-鳥苷酸二鈉（guanosine-5'-monophosphate，GMP）是主要的呈味核苷酸。故本研究測定了發(fā)酵60 d的魚肉水解液中核苷酸含量，其液相色譜圖見圖7。由圖7可知，不同耐鹽細菌發(fā)酵的魚肉水解液中無IMP和GMP，分析原因可能是發(fā)酵液提供的酸性環(huán)境，使得IMP和GMP分解為肌酐和黃嘌呤[21]。

圖7 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60 d時呈味核苷酸含量檢測高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of flavor nucleotides contents in hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.5 不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中組胺檢測結(jié)果

組胺是水產(chǎn)品中最主要的生物胺[22]，主要由微生物的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸脫羧生成[23]，危及人體健康。故該研究對魚肉水解液中組胺含量進行了測定，結(jié)果見圖8。由圖8可知，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中未檢測到組胺。而UDOMSIL N等[20]發(fā)現(xiàn)接種嗜鹽四聯(lián)球菌能降低魚肉水解液中的組胺含量，這與本研究的測定結(jié)果不一致。分析原因可能是本研究采用的無菌的魚肉水解液作為發(fā)酵原料，發(fā)酵過程中僅受接種菌株的影響。而UDOMSIL N等研究中使用的是未滅菌的魚肉水解液，其中涉及的微生物不只是嗜鹽四聯(lián)球菌，組胺的生成可能是多種微生物共同作用的效果。由此推測，本研究中篩得的5株耐鹽乳酸菌可能不產(chǎn)生組胺。

圖8 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60天時組胺含量檢測液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of histamine contents in fish hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.6 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液感官評價結(jié)果

對不同菌株發(fā)酵的魚肉水解液進行感官評價，結(jié)果見圖9。由圖9可知，接種嗜鹽四聯(lián)球菌JL-B發(fā)酵的魚肉水解液在其透明度、酯香、醬香、鹵肉味、鮮味的得分分別為5.5、5.5、5.3、3.6、3.8，均高于其他菌株發(fā)酵的魚肉水解液。接種嗜鹽四聯(lián)球菌JL-B的魚肉水解液為淺棕色的透亮液體，有濃郁的酯香及醬香。該魚肉水解液的鮮味、鹵肉味可接受程度更高，但是甜味并非是最突出的。綜合各種感官評價的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，接種嗜鹽四聯(lián)球菌JL-B的魚肉水解液被感官評價參與者的接受度最高。

圖9 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60 d時感官評定結(jié)果Fig.9 Sensory evaluation results of fish hydrolysate inoculated with different strains after 60 d fermentation

3 結(jié)論

本研究從魚露中篩選獲得5株耐鹽乳酸菌，編號分別為JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，鑒定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均為嗜鹽四聯(lián)球菌，菌株JL-F為表皮葡萄球菌。然后對5株耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性進行了研究。結(jié)果表明：不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解的pH值、總酸度及菌落數(shù)在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。5株耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解液的pH值、AAN和TVBN存在顯著差異（P＜0.05），而TSN的含量并無顯著差異（P＞0.05）。不同菌株發(fā)酵的魚肉水解液中均未檢測到呈味的IMP和GMP且未檢測到組胺。經(jīng)感官評價，4株嗜鹽四聯(lián)球菌存在差異，接種嗜鹽四聯(lián)球菌JL-B的魚肉水解液在風(fēng)味和氣味上被消費者接受的程度更高。

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