趙慧君，葛東穎，沈 馨，吳 競，劉 偉，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021）

襄陽大頭菜的腌制主要在腌制池或缸中進(jìn)行，長達(dá)18個月的“三腌、五鹵、六曬”過程中，有些腌制池或缸表面會形成一層白色的膜醭，導(dǎo)致大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，使產(chǎn)品品質(zhì)下降甚至失去經(jīng)濟(jì)價值。高需氧的酵母利用食品成分作為培養(yǎng)基生長，在液體表面酵母生長形成膜醭覆蓋或漂在產(chǎn)品的表面[1]。VOLLEKOVA A等[2]采用純培養(yǎng)的方法從紅酒的表面生物膜中分離到4株酵母菌；ECHEVERRIGARAY S等[3]從巴西葡萄酒中分離得到了6個種的酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均可以在不同的碳源下形成生物膜；饒瑜等[4]對泡菜生物膜中真菌進(jìn)行分離，研究表明，Pichia kluyveri和Geotrichum candidum可以導(dǎo)致生物膜的形成。值得一提的是，徐婷等[5]使用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)的方法從長有生物膜的襄陽大頭菜鹵水中分離了1株酵母菌，并鑒定其為魯氏酵母菌（Zygosaccharomycesrouxii）。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）基于宏基因組學(xué)的研究策略，通過將環(huán)境樣品中微生物的基因組混合作為一個整體進(jìn)行研究，不僅揭示了微生物群體的物種組成及豐度信息，亦可以解析物種的生物功能，打破了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的局限性[6]。目前PCR-DGGE技術(shù)廣泛應(yīng)用于紅酒[7]、意大利發(fā)酵干酪[8]、郫縣豆瓣醬[9]、單貝[10]、水果泡菜[11]等很多發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析。

本研究首先基于PCR-DGGE技術(shù)研究了襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液與長膜醭腌制液中酵母的多樣性，分析可能產(chǎn)膜醭的酵母菌；然后利用純培養(yǎng)的方法分離、純化和鑒定膜醭中存在的酵母菌。以期揭示襄陽大頭菜腌制液中膜醭的產(chǎn)生與酵母的關(guān)系，為襄陽大頭菜的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

本實驗所用材料采集于襄陽孔明菜食品有限公司。分別在6個正常發(fā)酵大頭菜池和6個長膜醭的大頭菜池里采集腌制液和膜醭，采集后4℃保存，帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.1.2 實驗試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：北京博奧星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；聚丙烯酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺（均為分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01DNA提取試劑盒：OMEGA公司；DNA Marker：Fermentas公司；PCR清潔試劑盒：美國AXYGEN公司；2×PCR mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和測序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE Ci-L顯微鏡：日本NiKon公司；VeritiTMDX熱循環(huán)儀、Nanodrop 2000：美國Thermo Fisher公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System：美國Bio Red公司；Fluor Chem FC3凝膠成像儀：美國Protein Simple公司；Bio 5000plus掃描儀：上海中晶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因組DNA的提取與檢測

按照試劑盒上的步驟提取兩種大頭菜腌制液各6個樣品的宏基因組DNA，其中大頭菜長膜醭腌制液是將膜醭和腌制液充分混勻后進(jìn)行DNA提取，提取后用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測并用Nanodrop 2000分光光度計測定DNA的濃度和質(zhì)量，將符合實驗要求的DNA樣品濃度調(diào)整一致后放入-20℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域序列

將提取的宏基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為NL1（F）-GC（5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC CCGCCG CCCCCG CCCCGCGAT ATCAAT AAG CGG AGGAAAAG-3'），反向引物為LS2（5'-ATTCCCAAACAA CTC GAC TC-3'）[12]，PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL NL1（F）-GC（10 mmol/L），0.5 μL LS2（10 mmol/L），0.5 μL rTaq酶（5 U/μL），1 μL DNA模板，18 μL無菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、4 min 預(yù)變性，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 DGGE及數(shù)據(jù)分析

采用質(zhì)量濃度為80 g/L的聚丙烯酰胺，變性劑線性梯度為25%～55%的凝膠進(jìn)行電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為10 μL（包含10x上樣緩沖液）。電泳時，溫度為恒溫60℃，120V，78min；80V，13h。電泳結(jié)束對聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染顯色[13]，顯色結(jié)束后用掃描儀采集圖片，并用Quantity One軟件分析圖片。

1.3.4 DGGE條帶的切割、克隆及測序

切割DGGE膠上的優(yōu)勢條用50 μL無菌水在4℃浸泡過夜后作為模板，用不含GC夾子的引物（NL1和LS2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果并用PCR清潔試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔，清潔后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，鑒定陽性克隆并將陽性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 測序產(chǎn)物的比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

提取測序結(jié)果中的目的序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取相似度比較高的相似的序列，用MEGA5.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接法（neighbor joining，NJ）制作系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]，利用Bootstrap（自展法）檢測制作的系統(tǒng)樹[15]，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.3.6 產(chǎn)膜醭酵母菌的分離與純化

將襄陽大頭菜上的膜醭在超凈臺中用無菌手術(shù)刀刮下后放入無菌水中，進(jìn)行梯度稀釋梯度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每個梯度各取0.5 mL的均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)1 d左右。取長出的單菌落后依照形態(tài)、顏色和大小等特征選取目的菌株，再劃線純化兩次，進(jìn)行形態(tài)觀察和鏡檢，然后將純化的菌株保存在-80℃冰箱中待用。

1.3.7 產(chǎn)膜醭酵母菌的分子生物學(xué)鑒定[16-17]

采用消解酶-氯化芐法提取酵母DNA，以所提取的大頭菜酵母菌總的DNA為模板進(jìn)行分離酵母菌株26S rDNA D1/D2可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增，使用的引物為NL1（5'-GCG ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）。PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCRBuffer（含Mg2+），2μLdNTP（2.5mol/L），0.5μLNL1（10mmol/L），0.5 μLNL4（10mmol/L），0.5 μLrTaq（5U/μL），1 μL DNA模板，18 μL無菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、4 min預(yù)變性，95℃、1min，58℃、30s，72℃、1min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TOP10，鑒定陽性克隆并送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序后提取酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列與NCBI上的模式菌株進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹，方法同1.3.5。

2 結(jié)果與分析

2.1襄陽大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)下腌制液樣品26S rDNA區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭腌制液樣品宏基因組DNA提取并檢測后，作為模板擴(kuò)增酵母菌26SrDNA D1/D2區(qū)域基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為200bp且無特異性擴(kuò)增，用來進(jìn)行DGGE。襄陽大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)腌制液DGGE圖譜見圖1。從圖1中可以看出，在相同上樣量（10μL）的條件下電泳條帶的亮度差異很大，特別是條帶2和條帶5，在襄陽大頭菜長膜醭腌制液樣品中亮度增加，且長膜醭腌制液的所有條帶因為DNA含量高而呈現(xiàn)彌散狀態(tài)。

圖1 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭腌制液的酵母DGGE圖譜Fig.1 DGGE analysis of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

2.2 DGGE圖譜聚類分析

樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性可以由不同樣品間共有條帶數(shù)目的多少來反映。采用UPGMA的方法對襄陽大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)腌制液樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性評估，酵母聚類分析見圖2。由圖2可知，襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭的腌制液被分為了不同的類別。由此推斷，酵母菌與大頭菜腌制液長膜醭之間存在著一定的關(guān)系。

圖2 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭腌制液的酵母聚類分析Fig.2 Cluster analysis of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

2.3 DGGE條帶測序及同源性分析

對襄陽大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)腌制液樣品DGGE圖譜上的代表性亮帶進(jìn)行切膠、擴(kuò)增、克隆和測序，與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上的模式菌株進(jìn)行比（見表1）對并構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖3）?？偣矊?個條帶進(jìn)行了測序，條帶對應(yīng)圖1中的編號。由表1可知，所有條帶的序列與NCBI中模式菌的序列的相似性均在99%～100%，說明鑒定具有意義。由圖1可知，編號為2和5的條帶在長膜醭的襄陽大頭菜腌制液中亮度高于正常發(fā)酵的腌制液，測序結(jié)果為魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii）。

表1 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭腌制液的細(xì)菌DGGE條帶比對結(jié)果Table 1 Comparison results of DGGE band of bacteria in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

圖3 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列構(gòu)建的襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜腌制液中酵母系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 region gene sequences of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

由測序結(jié)果和進(jìn)化樹可以看出，在襄陽大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)腌制液中優(yōu)勢酵母菌的種類只有兩種，即魯氏酵母和漢遜德巴利酵母，且漢遜德巴利酵母的多樣性高于魯氏酵母。

2.4 襄陽大頭菜膜醭中酵母菌的分離、純化與鑒定

以純培養(yǎng)的方式從襄陽大頭菜的膜醭中共分離純化出8株酵母菌，經(jīng)測序和與NCBI上模式菌株比對（見表2）和構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖4）結(jié)果與DGGE測序結(jié)果一致，也均為魯氏酵母和漢遜德巴利酵母。由此可見，襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜醭腌制液中優(yōu)勢酵母菌的種類相同且種屬相對單一。由此推斷，襄陽大頭菜腌制液在發(fā)酵過程中膜醭的形成與魯氏酵母和漢遜德巴利酵母的過度繁殖之間存在著必然的聯(lián)系。

表2 分離菌株的比對結(jié)果Table 2 Comparison results of isolated strains

圖4 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列構(gòu)建膜醭中酵母系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 region gene sequences of yeast in the surface film

3 結(jié)論

本研究基于PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合純培養(yǎng)的方法研究了襄陽大頭菜產(chǎn)膜醭的酵母菌，發(fā)現(xiàn)襄陽大頭菜正常腌制液與長膜醭腌制液相比，酵母菌的種類相同且單一，均為魯氏酵母和漢遜德巴利酵母。魯氏酵母和漢遜德巴利酵母在少量存在的時候可以增添食品的風(fēng)味，大量存在時可以產(chǎn)膜醭。在有膜醭的大頭菜腌制液中，魯氏酵母和漢遜德巴利酵母的生物量顯著增加，因此推斷，襄陽大頭菜中的膜醭是可能是由于魯氏酵母和漢遜德巴利酵母的過度繁殖造成的，后續(xù)將對分離的兩種酵母進(jìn)行進(jìn)一步的研究和驗證。

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