王楠 陸金華 林勝友★

黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，對(duì)抗化療引起的免疫抑制，提高宿主免疫力，降低化療藥物對(duì)機(jī)體傷害作用等功能［1-2］。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是腫瘤免疫的主要組成部分，而采用化療藥物治療會(huì)對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用，影響細(xì)胞免疫［3-4］。細(xì)胞凋亡和自噬都是生物體內(nèi)高度保守的生物過程，而這兩個(gè)通路中有部分成分可以相互作用，同時(shí)可以被相同的刺激誘導(dǎo)發(fā)生?；熕幬锬軌蛟鰪?qiáng)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的自噬，同時(shí)引起T淋巴細(xì)胞凋亡。本資料主要擬研究黃芪多糖對(duì)大鼠T細(xì)胞順鉑處理后自噬相關(guān)基因mRNA與蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響，探究黃芪多糖是否能夠?qū)樸K引起的T細(xì)胞自噬和凋亡產(chǎn)生抑制作用，對(duì)抗化療引起的T細(xì)胞損傷。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材 試劑：黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物有限公司，順鉑注射液購(gòu)自Hospira（H20090521），RPMI 1640（Gibco），F(xiàn)etal Bovine Serum（Gibco），1%青霉素-鏈霉素混合液（Hyclone公司），Quick Start? Bradford Protein Assay（BioRad 公 司 ），anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC均購(gòu)自CST，Anti-GAPDH （Sigma：G8795），Anti-Caspase3 （CST：9662），Anti-Class I PI3K （SantaCruz：SC7189），Anti-Class III PI3K （SantaCruz：SC134986），Anti-Apg5 （SantaCruz：SC33210），Anti-Beclin1 （CST：3459），Anti- mTOR （SantaCruz：SC8319），Anti-LC3I/II（Sigma：L7543），Goat anti-Rabbit IgG-HRP（Life Tech公司），TRIzol試劑（Invitrogen），PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara），Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（RPN2236）；Annexin V-FITC（Cell signaling）。儀器：CFX Connect Real-Time System（Biorad）；NanoDrop 2000（Thermo Scientific公 司 ）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermofisher）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（SpectraMax Plus 384型，美國(guó)MD）；Mini-Proten Tetra System（Bio-RAD）。

1.2 大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng) 取6～8周齡SD大鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟，采用手術(shù)剪將其剪至5mm×5mm小塊，并用載玻片研碎，加入PBS制作成脾臟細(xì)胞懸液，采用200目篩過濾，收集單細(xì)胞濾液并采用1500rpm離心5min沉淀細(xì)胞，采用PBS重懸后滴加至等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，1900rpm水平離心20min，收取淋巴細(xì)胞層，加入5倍體積細(xì)胞洗滌液漂洗，1500rpm離心5min并收集淋巴細(xì)胞沉淀，采用RPMI1640加10%FBS及1×青鏈霉素混合液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml，5% CO2條件下37℃恒溫濕式培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞類型及細(xì)胞凋亡 T細(xì)胞類型檢測(cè)：取新分離的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后400g離心3min收集50萬(wàn)細(xì)胞，采用100μl 1%BSA重懸細(xì)胞，加入anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC各2.5μl，混勻后4℃孵育30min，再加入1ml預(yù)冷的PBS洗去多余抗體，400g離心5min，再加入300μl PBS重懸細(xì)胞，采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC，收集1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞信號(hào)，并采用FlowJo 7.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取新分離的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞1×107個(gè)，分別采用（1）等體積的PBS。（2）625μg/ml的黃芪多糖。（3）40μm的順鉑。（4）40μm順鉑加625μg/ml的黃芪多糖處理24h，離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞采用100μl 1%BSA重懸，加入Annexin V-FITC 2.5μl，Propidium Iodide （PI）1μl在4℃雙染30min，再加入1ml預(yù)冷的PBS洗去多余抗體，400g離心5min，再加入300μl PBS重懸細(xì)胞，采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC，Propidium Iodide，采用FlowJo 7.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 熒光定量PCR 取新分離的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞4×107個(gè)，按1.3方法處理12h和24h，離心收集細(xì)胞。采用TRIzol試劑（Invitrogen）提取淋巴細(xì)胞總RNA，并用NanoDrop 2000對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量。采用PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara）進(jìn)行cDNA合成。熒光定量PCR試劑盒為SuperReal PreMix Color（SYBR Green），在CFX Connect Real-Time System（96孔）上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)并用BIO-RAD CFX Manager 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)40次。采用GAPDH基因作為內(nèi)參，每個(gè)樣品測(cè)定3次，目的基因表達(dá)量變化采用與GAPDH基因循環(huán)閾值比較進(jìn)行確定。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取新分離的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞3×107個(gè)，按1.3方法處理12h和24h，離心收集細(xì)胞。采用100μl IP裂解液裂并加入蛋白酶抑制劑cocktail（Roche公司）4℃裂解過夜，在4 ℃ 13000rpm離心30min收集含蛋白上清液，采用Quick Start? Bradford Protein Assay進(jìn)行蛋白定量，最后調(diào)整蛋白濃度為2μg/μl后凍存在-80℃?zhèn)溆?。Western blot垂直電泳條件為10% Gel，上層膠80V，下層膠120V，轉(zhuǎn)膜條件為80V 100min，封閉液為5% non-fat milk（Biorad公司），一抗為Anti-TUBULIN （SantaCruz：SC5286），Anti-Caspase3 （CST：9662），Anti-Class I PI3K （SantaCruz：SC7189），Anti-Class III PI3K （SantaCruz：SC134986），Anti-Atg5 （SantaCruz：SC33210），Anti-Beclin1 （CST：3459），Anti- mTOR （SantaCruz：SC8319），Anti-LC3I/II（Sigma：L7543），二抗為Goat anti-Rabbit IgG-HRP（Life Tech公司），顯色液為Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（RPN2236）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的分離和鑒定 取6～8周齡SD大鼠脾臟，研磨后采取淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴T細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定，結(jié)果如圖1所示，分離得到CD3+淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞比例為67.9%，其中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例為27.9%，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例為64.2%。

2.2 黃芪多糖對(duì)順鉑處理后T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)影響 取新鮮分離的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞，分為空白對(duì)照組（加等體積的PBS），順鉑組（加40μm的順鉑），黃芪多糖組（加625μg/ml的黃芪多糖），黃芪多糖順鉑組（40μm順鉑加625μg/ml的黃芪多糖處理），分別處理12h和24h，離心收集細(xì)胞，提取總RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)mTOR﹑ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑Atg5﹑Beclin1的表達(dá)量。結(jié)果見表1﹑2。

表1 藥物處理12h后大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)變化［n=3，（）］

表1 藥物處理12h后大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)變化［n=3，（）］

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR Beclin1空白對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00順鉑組 1.35±0.05 * 3.21±0.18 ** 2.55±0.13** 1.95±0.12** 1.75±0.08**黃芪多糖組 0.95±0.04 1.18±0.09 1.23±0.07 1.11±0.09 1.05±0.06順鉑黃芪多糖組 1.16±0.04 *# 2.56±0.13 **## 1.78±0.15**# 1.43±0.08*# 1.35±0.07*#

表2 藥物處理24h后大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)變化［n=3，（）］

表2 藥物處理24h后大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)變化［n=3，（）］

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 ATG5 ClassⅢPI3K ClassⅠPI3K mTOR Beclin1空白對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00順鉑組 2.95±0.24** 3.56±0.23** 2.41±0.15** 3.45±0.26** 2.86±0.19**黃芪多糖組 0.93±0.05 1.12±0.08 1.21±0.08 1.02±0.05 1.01±0.05順鉑黃芪多糖組 1.38±0.06*# 3.08±0.19**## 2.14±0.25**## 1.67±0.11**## 1.85±0.15**##

2.3 黃芪多糖對(duì)順鉑處理后T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響 如圖2所示，順鉑處理T淋巴細(xì)胞12h或24h后，自噬相關(guān)蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3表達(dá)量明顯上升，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)也明顯上升，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR蛋白表達(dá)下降，表明順鉑處理導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞自噬和凋亡增加。采用黃芪多糖處理T淋巴細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)變化不明顯，而順鉑加黃芪多糖處理T淋巴細(xì)胞12h和24h后，自噬相關(guān)蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3表達(dá)明顯低于順鉑組，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)也明顯降低，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表達(dá)上升，表明黃芪多糖能夠抑制順鉑導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞自噬和凋亡。

圖1 大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.4 黃芪多糖對(duì)順鉑處理后T淋巴細(xì)胞凋亡的影響 如圖3所示，在Annexin V-FITC 和Propidium Iodide （PI）雙陽(yáng)性的細(xì)胞中，順鉑組雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為15.8%，正常對(duì)照組為5.55%，黃芪多糖組為8.77%，順鉑黃芪多糖組為11.2%，表明黃芪多糖能夠改善順鉑引起的T細(xì)胞凋亡發(fā)生。

圖2 黃芪多糖對(duì)順鉑處理后T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響

圖3 黃芪多糖對(duì)順鉑處理后T淋巴細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞自噬和凋亡可以相互作用，拮抗或者協(xié)同，影響細(xì)胞命運(yùn)，自噬和凋亡相關(guān)的關(guān)鍵分子存在交叉及相互作用。Insulin-IGF-1信號(hào)減弱，營(yíng)養(yǎng)或能量限制等細(xì)胞代謝壓力會(huì)導(dǎo)致mTOR活性下調(diào)，引起mRNA轉(zhuǎn)錄抑制以及自噬，同時(shí)mTOR的下游分子還包括p53，BAD和BCL-2等凋亡相關(guān)分子。Beclin 1是酵母Atg6基因的同系物，多方面證據(jù)顯示Beclin 1參與了自噬和凋亡的相互作用，研究表明Beclin 1和抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2，BCL-XL之間有功能上和結(jié)構(gòu)上的相互作用［5-6］。細(xì)胞凋亡引起的Caspase激活可以裂解Beclin 1和PI3K等。前期研究表明，T淋巴細(xì)胞在化療藥物作用后，會(huì)產(chǎn)生過多的自噬，并且凋亡也會(huì)增加。

本研究通過分離大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞并在體外培養(yǎng)，采用黃芪多糖和順鉑處理，研究黃芪多糖對(duì)順鉑引起的T淋巴細(xì)胞自噬和凋亡的影響。結(jié)果表明，順鉑能夠引起T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因mTOR﹑ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑Atg5﹑Beclin1的mRNA表達(dá)上升，并且處理24h上升效果明顯高于12h，而采用黃芪多糖加順鉑處理后，自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組相比仍然有上升，但是與順鉑組相比，其自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量明顯下降，表明黃芪多糖對(duì)順鉑引起的T淋巴細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)具有抑制作用。在Western blot檢測(cè)中，采用順鉑處理后自噬相關(guān)蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3均有明顯升高，同時(shí)ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表達(dá)降低，而在加入黃芪多糖后，Atg5﹑Beclin1﹑LC3﹑Caspase-3表達(dá)與順鉑組相比有不同程度下降，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表達(dá)上升，表明黃芪多糖對(duì)順鉑引起的T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有抑制作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡也有抑制。通過流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC 和Propidium Iodide（PI）雙陽(yáng)性凋亡細(xì)胞在順鉑處理后明顯多于正常對(duì)照組，而加入黃芪多糖后明顯降低，表明黃芪多糖可以降低順鉑引起的T細(xì)胞凋亡。

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