黃小春 胡祖良 張?jiān)待?鄭敏 趙建 張東泉★

本課題組的前期研究表明，鹽酸四環(huán)素治療能夠顯著改善全氟異丁烯（PFIB）吸入性急性肺損傷，而且能劑量依賴性的抑制肺組織和支氣管肺灌洗液（BALF）中MMP-2活性，其中高劑量TET治療可使肺組織中MMP-2活性降至正常水平［1］。因此針對蛋白分解酶的抑制藥物有望在治療PFIB吸入性肺損傷中發(fā)揮作用。由于鹽酸四環(huán)素的毒性不良反應(yīng)，目前已在我國近于淘汰，因此，作者選用多西環(huán)素于2016年6月至12月通過動物實(shí)驗(yàn)研究，觀察多西環(huán)素（DOX）對PFIB吸入致大鼠吸入性急性肺損傷（ALI）的防治效果，以期為尋求ALI 的有效治療藥物提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PFIB（上海有機(jī)氟材料研究所，純度：98%）；BSA224S 分析天平（德國Sartorius 公司）；DOX（純度99%）。

1.2 方法與分組 （1）實(shí)驗(yàn)動物：SPF級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～220g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。動物實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3d，自由飲食飲水，每籠飼養(yǎng)6只，于染毒前禁食1夜。180～200g體重 Wistar雄性大鼠。（2）分組：將 36只大鼠隨機(jī)分為6組，每組各6只，即：正常對照組（NC組），在PFIB染毒后1h，腹腔注射生理鹽水（1.0ml/100g）；DOX藥物對照組（DOX-C組），在空氣暴露后1h，腹腔注射生理鹽水（1.0ml/100g）；PFIB+NS組（PFIB-C組），在PFIB染毒后1h，腹腔注射生理鹽水（1.0ml/100g）；PFIB+DOX低劑量組（DOX-L組）：在PFIB染毒后1h，腹腔注射低劑量DOX（17.5 mg/kg）；PFIB+DOX中劑量組（DOX-M組），在PFIB染毒后1h，腹腔注射中劑量DOX（35mg/kg）；和PFIB+DOX高劑量組（DOX-H組），在PFIB染毒后1h，腹腔注射高劑量DOX（70mg/kg）。染毒前及染毒后24h稱量動物體質(zhì)量并記錄。（3）大鼠動態(tài)吸入PFIB 周身暴露的染毒方法：大鼠動態(tài)吸入PFIB 周身暴露染毒裝置及PFIB染毒濃度的測定方法詳見文獻(xiàn)［2］。

1.3 觀測指標(biāo) （1）肺系數(shù)測定：在PFIB染毒后24h，將實(shí)驗(yàn)動物麻醉后，經(jīng)腹主動脈放血處死。待血液排凈后，打開胸腔，分離出氣管并于氣管分叉處結(jié)扎右支氣管，將右氣管連同全肺及右肺副葉全部取出，剔除肺外組織，生理氯化鈉漂洗，濾紙吸干后測量濕肺凈重。計(jì)算肺系數(shù)：濕肺/體比=（濕肺凈重/體質(zhì)量）×10000。（2）BALF的制備及蛋白和磷脂含量測定：如上所述，在取出右肺后，經(jīng)左支氣管插管，參照文獻(xiàn)［2］所述方法制備BALF。Lowry法測BALF中總蛋白含量，采用Wako公司磷脂試劑盒測定磷脂含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFIB染毒前后大鼠肺組織大體病理學(xué)觀察 在PFIB亞致死劑量染毒后24h，解剖動物時，肉眼可見，PFIB對照組受試動物全肺呈現(xiàn)彌漫性水腫﹑瘀血表現(xiàn)，而在PFIB染毒后1h給予DOX治療的大鼠肺部瘀血﹑水腫等表現(xiàn)隨著DOX給藥劑量增加，逐漸減輕，但肺體積仍較正常對照組大（見圖1），多西環(huán)素治療PFIB染毒大鼠肺組織病理切片-HE染色（見圖2）。

圖1 DOX治療PFIB染毒后大鼠肺組織照片

圖2 DOX治療PFIB染毒大鼠肺組織病理切片-HE染色照片（20倍物鏡）

2.2 DOX治療對PFIB吸入性肺損傷的作用-肺質(zhì)量和肺系數(shù)結(jié)果 在DOX給藥劑量為17.5～70 mg/kg的范圍內(nèi)，隨著給藥劑量的增加，DOX可以劑量依賴性的降低濕肺重﹑濕肺體比，且以70 mg/ kg的治療效果最佳（見圖3）。

2.3 DOX治療對PFIB吸入性肺損傷的作用- BALF中蛋白和磷脂含量的變化 BALF中蛋白質(zhì)和磷脂含量變化與肺質(zhì)量變化相似，即在DOX給藥劑量為17.25～70 mg/kg的范圍內(nèi)，DOX治療組能夠顯著降低BALF中蛋白質(zhì)和磷脂含量，而且具有顯著的劑量依賴性（見圖4）。

圖3 DOX治療PFIB染毒大鼠的肺質(zhì)量與肺系數(shù)變化（0．01＜★★P＜0．001）

圖4 DOX治療PFIB染毒大鼠的肺勻漿及BALF中蛋白磷脂含量的變化（0．01＜★★P＜0．001；★★★P＜0．001）

3 討論

多西環(huán)素，一種化學(xué)修飾的四環(huán)素，其特異性的增強(qiáng)和保留了非抗生素的作用，具有免疫調(diào)節(jié)﹑抑制細(xì)胞因子合成，還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，并且也是一種廣譜的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑［3-4］。氟聚合物是工業(yè)生產(chǎn)過程中一種常見的副產(chǎn)物，PFIB是全氟丁烯的一種異構(gòu)體，多見于火災(zāi)等意外事故生成的有毒煙霧中，可穿透防毒面具［5］。研究表明，PFIB少量吸入即可產(chǎn)生ALI，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺水腫乃至死亡［6］。研究還表明，蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡在ALI發(fā)病過程中具有重要的作用和地位［7］。主要是ALI時肺局部聚集的中性粒細(xì)胞釋放過量的蛋白分解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和炎性因子如NF-kB﹑IL-1和TNF-α等所致。

PFIB吸入性肺損傷是由于中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集﹑活化，釋放蛋白酶﹑細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致血管通透性增加，損傷肺泡上皮屏障，導(dǎo)致Ⅰ型﹑Ⅱ型肺泡細(xì)胞的損傷壞死，肺氣血屏障通透性升高，形成肺損傷，進(jìn)而發(fā)展成為肺水腫。研究顯示在急性肺損傷組織中被激活的炎癥細(xì)胞釋放的各種組織損傷因子中，MMPs被認(rèn)為與ALI 密切相關(guān)。DOX是膠原酶和明膠酶的強(qiáng)效抑制劑。Wang J等［8］在H2S誘導(dǎo)的ALI模型中發(fā)現(xiàn)DOX可以通過抑制MMP-2和MMP-9活性，從而減輕ALI。Ng HH等［4］在流感病毒導(dǎo)致的ALI模型中發(fā)現(xiàn)DOX減少炎癥反應(yīng)，抑制MMPs表達(dá)，從而減輕ALI。在本研究中肺濕干重比是反映肺組織損傷程度的良好指標(biāo)，聯(lián)合BALF中蛋白質(zhì)含量更能反映肺損傷的嚴(yán)重程度。從數(shù)值上看，DOX治療組的肺系數(shù)﹑BLAF蛋白質(zhì)和磷脂含量顯著低于PFIB-C組，以高劑量差異顯著，提示高劑量DOX可以減輕PFIB 誘導(dǎo)的ALI的病變嚴(yán)重程度，減少ALI時的蛋白滲出，并抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蛋白酶抑制劑DOX可減輕PFIB吸入性ALI，降低ALI 的嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能預(yù)期是蛋白酶抑制劑能降低肺泡毛細(xì)血管通透性，減輕肺泡上皮屏障損傷，減少ALI 時的蛋白滲出，并抑制ALI 時炎癥介質(zhì)釋放，減輕失控性的炎癥反應(yīng)有關(guān)。對于尋找專一性較強(qiáng)的酶抑制劑，將會明顯提升PFIB 吸入性肺損傷的防治能力，并有利于推進(jìn)PFIB ALI發(fā)病機(jī)制的研究。

［1］ 趙建,丁日高,阮金秀,等．鹽酸四環(huán)素對全氟異丁烯吸入性肺損傷的防治效果研究．中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2005,1:14-17．

［2］ 王麗君,郝建 ,趙建,等．抑肽酶對全氟異丁烯誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的影響及其機(jī)制．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,11:1600-1604．

［3］ 陳薇,付翔,黃鸝鶯姿,等．多西環(huán)素抑制金屬蛋白酶藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展．中國藥師,2015,18(3):482-484．

［4］ Ng HH,Narasaraju T,Phoon MC,et al．Doxycycline treatment attenuates acute lung injury in mice infected with virulent influenza H3N2 virus: involvement of matrix metalloproteinases．Exp Mol Pathol,2012,92(3):287-295．

［5］ Luzina EL, Popov AV． Synthesis of 3,3,3-trifluoroethyl isocyanate,carbamate and ureas．Anticancer activity evaluation of N-(3,3,3-trifluoroethyl)-N'-substituted ureas． J Fluor Chem,2015, 176:82-88．

［6］ Luh SP,Chiang CH．Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome(ALI/ARDS): the mechanism, present strategies and future perspectives of therapies．J Zhejiang Univ Sci B,2007,8(1):60-69．

［7］ Davey A,McAuley DF,O'Kane CM．Matrix metalloproteinases in acute lung injury: mediators of injury and drivers of repair．Eur Respir J,2011,38(4):959-970．

［8］ Wang J, Zhang H, Su C, et al． Dexamethasone ameliorates H(2)S-induced acute lung injury by all eviating matrix metalloproteinase-2 and -9 expression．PLoS One, 2014, 9(4): e94701．