李樹(shù)坡，李鵬，余捍東，趙晶

肺癌是居于我國(guó)城鎮(zhèn)居民發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率一直呈上升的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占85%［1］。研究報(bào)道，NSCLC患者血清雌激素水平高于其他類(lèi)型肺癌和正常人群［2］，經(jīng)抗雌激素治療可顯著提高患者的生存率，提示血清雌激素水平在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用［3］。研究表明，微小RNA（miRNA）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，其表達(dá)水平在腫瘤中表現(xiàn)為上調(diào)或者下調(diào)，同時(shí)伴隨相關(guān)功能的改變，提示miRNA在腫瘤的診斷和治療中具有較大的應(yīng)用前景［4］。在與血清雌激素水平相關(guān)的腫瘤（乳腺癌）中，miR-365表達(dá)水平發(fā)生變化，并且與血清雌激素水平存在關(guān)聯(lián)［5］。與血清雌激素水平關(guān)系密切的NSCLC、miR-365表達(dá)水平如何，是否存在與乳腺癌類(lèi)似的變化尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)分析NSCLC患者血清雌激素水平與miR-365表達(dá)水平的變化及其相關(guān)性，以期為NSCLC的早期診斷和治療提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年3月—2016年4月在三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院接受原發(fā)性NSCLC手術(shù)切除的57例患者作為NSCLC組，其中男35例，女22例；年齡47～73歲，平均年齡（59.5±5.8）歲；病理類(lèi)型：腺癌31例，鱗狀細(xì)胞癌22例，腺鱗癌4例；TNM分期按照國(guó)際肺癌研究會(huì)（IASLC）公布的標(biāo)準(zhǔn)［6］，其中Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：為初次發(fā)現(xiàn)并在本院接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有內(nèi)分泌、女性生殖系統(tǒng)疾病和其他系統(tǒng)腫瘤。選取同期本院體檢中心體檢健康者50例作為對(duì)照組，其中男38例，女12例；年齡46～70歲，平均年齡（57.7±6.4）歲。對(duì)照組經(jīng)檢查均無(wú)肝、肺、腎、腦等疾病，無(wú)消化道和血液系統(tǒng)疾病史。本研究經(jīng)三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 雌二醇ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Linco Research公司）；miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒與miScript SYBR Green PCR試劑盒（QIAGEN公司）；Trizol-LS（美國(guó)Invitrogen公司）；Smart Spec plus核酸蛋白檢測(cè)儀（美國(guó) Bio-Rad公司）；Light Cycler 480Ⅱ基因擴(kuò)增檢測(cè)儀（德國(guó)Roche公司）；引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成并修飾。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 收集對(duì)照組性別、年齡，收集NSCLC組性別、年齡、吸煙（吸煙定義為20支/d，持續(xù)10年）情況、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.3.2 檢測(cè)血清雌激素水平 研究對(duì)象于清晨空腹抽靜脈血3～5 ml，3 000 r/min離心10 min（離心半徑5 cm），分離血清，吸取上清液后迅速置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)研究對(duì)象血清雌二醇水平，即血清雌激素水平。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）法檢測(cè)miR-365表達(dá)水平 采用Trizol-LS提取外周血中總RNA，采用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Smart Spec plus核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)OD260/280，計(jì)算miRNA的含量及純度。cDNA樣本置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。miR-365上游引物為5'-UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU-3'，下游引物為5'-AAGGAUUUUUAGGGGCAUUAUU-3'；內(nèi)參U6的上游引物為 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。配成 25 μl反應(yīng)體系，不足部分用H2O 補(bǔ)齊。Light Cycler 480Ⅱ基因擴(kuò)增檢測(cè)儀設(shè)置的反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算miR-365表達(dá)水平，所有樣品均做3個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；血清雌激素水平與miR-365表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組性別、年齡比較 兩組研究對(duì)象性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.89，P=2.38；t=1.35，P=0.18）。

2.2 血清雌激素水平比較 NSCLC組血清雌激素水平為（145±49）pmol/L，其中男性患者為（127±35）pmol/L，女性患者為（165±63）pmol/L；對(duì)照組血清雌激素水平為（87±38）pmol/L。NSCLC組血清雌激素水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.73，P=0.01）。在NSCLC組中，男性患者血清雌激素水平與女性患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.87，P=0.07）。

2.3 兩組miR-365表達(dá)水平比較 NSCLC組miR-365表達(dá)水平為（0.57±0.43），對(duì)照組為（1.15±0.48）。NSCLC組miR-365表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.65，P=0.02）。

2.4 不同特征NSCLC患者miR-365表達(dá)水平比較不同性別、年齡、吸煙情況NSCLC患者miR-365表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同組織學(xué)類(lèi)型NSCLC患者miR-365表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌NSCLC患者miR-365表達(dá)水平高于腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同分化程度NSLCL患者miR-365表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低分化NSCLC患者miR-365表達(dá)水平低于高分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的NSCLC患者miR-365表達(dá)水平高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者miR-365表達(dá)水平低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.5 NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達(dá)水平的相關(guān)性 NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57，P=0.02）。

3 討論

肺癌是非內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，血清雌激素水平與肺癌的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)［2］。已有研究證實(shí)，血清雌激素水平可通過(guò)調(diào)節(jié)c-myc、c-fos等基因的表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ、與細(xì)胞周期有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，減少腫瘤抑制性生長(zhǎng)因子的合成等多種途徑參與肺癌的發(fā)生發(fā)展［7-8］。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組血清雌激素水平高于對(duì)照組，提示血清雌激素水平可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，與其他研究結(jié)果一致［3，9］。HSU等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清雌激素水平較同性別正常對(duì)照人群顯著升高，而在NSCLC患者間無(wú)性別差異；CHE等［3］的研究也表明NSCLC患者經(jīng)過(guò)抗雌激素治療后，可以顯著提高順鉑治療的依從性，表明血清雌激素水平升高與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸存在關(guān)聯(lián)。

miRNA是一組具有21～25個(gè)堿基對(duì)的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，且核苷酸序列高度保守，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等活動(dòng)［10］。多項(xiàng)研究表明，miRNA在腫瘤組織中表現(xiàn)出特異性的表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，這一現(xiàn)象為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路［11-12］。研究表明，miR-365參與抑制腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程［13］。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組miR-365表達(dá)水平低于對(duì)照組，不同組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者miR-365表達(dá)水平間有差異，預(yù)示著miR-365可能參與了疾病的發(fā)展過(guò)程或者是疾病發(fā)展的觀測(cè)指標(biāo)。研究證實(shí)，在胃癌中miR-365 主要通過(guò)作用于靶分子cyclin D1和CDK4 /6而調(diào)控細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［14］。KANG等［15］的研究也證實(shí)miR-365表達(dá)水平與甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1呈負(fù)相關(guān)，而NKX2-1是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要靶點(diǎn)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-365 模擬劑后發(fā)現(xiàn)能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而miR-365抑制劑卻能使腫瘤細(xì)胞少量增殖。

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

注：與腺癌比較，aP＜0.05；與高分化比較，bP＜0.05；c為F值

項(xiàng)目 例數(shù) miR-365表達(dá)水平 t（F）值 P值性別男35 0.52±0.38 1.18 0.28女22 0.62±0.41年齡（歲）＜60 18 0.67±0.42 1.07 0.36≥60 39 0.43±0.26吸煙情況有33 0.61±0.39 1.16 0.31無(wú)24 0.49±0.41組織學(xué)類(lèi)型腺癌 31 0.27±0.19 3.51c ＜0.01鱗狀細(xì)胞癌 22 0.77±0.51a腺鱗癌 4 0.91±0.35a分化程度高分化 6 0.87±0.28 2.07c 0.04中分化 33 0.59±0.43低分化 18 0.37±0.31b TNM分期Ⅰ～Ⅱ期 33 0.87±0.23 2.63 0.01Ⅲ～Ⅳ期 24 0.31±0.19淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)轉(zhuǎn)移 26 0.77±0.35 2.27 0.03有轉(zhuǎn)移 31 0.36±0.28

雖然miR-365表達(dá)水平在乳腺癌中的變化已有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，但在肺癌中的表達(dá)情況及其與血清雌激素水平的關(guān)聯(lián)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組血清雌激素水平與miR-365表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這表明NSCLC的發(fā)生發(fā)展可能與血清雌激素水平及其調(diào)控因子有關(guān)，但血清雌激素水平的變化與miRNA表達(dá)異常的因果關(guān)系如何，值得進(jìn)一步研究。

本研究雖然觀察到血清雌激素水平和miR-365表達(dá)水平與NSCLC的腫瘤生物學(xué)特征存在一定關(guān)系，但是也存在樣本量偏小、觀察追蹤時(shí)間短等不足。后續(xù)研究中，在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)，增加對(duì)患者的觀察時(shí)間，進(jìn)一步明確兩者的關(guān)聯(lián)，將為NSCLC的早期診斷或療效觀察提供新的選擇。

綜上所述，NSCLC患者血清雌激素水平高于正常人群，miR-365表達(dá)水平低于正常人群，且兩者具有相關(guān)性，可為NSCLC患者的早期診斷和治療提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：李鵬進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫(xiě)論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；余捍東、趙晶進(jìn)行資料收集整理、試驗(yàn)實(shí)施與評(píng)估、資料收集；李樹(shù)坡進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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（收稿日期：2017-12-11；修回日期：2018-02-21）

（本文編輯：劉新蒙）