劉志芳， 嚴(yán) 紅， 鄭榮泉，3， 張啟鵬， 梅祎蕓，王志剛， 洪 燕， 周婷婷

(1.浙江師范大學(xué) 野生動(dòng)物保護(hù)與利用技術(shù)中心,浙江 金華 321004；2.浙江師范大學(xué) 野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004；3.浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華 321004)

環(huán)境雄激素主要包括天然雄激素與合成雄激素.天然雄激素包括睪酮(testosterone)及其衍生物雄酮(androsterone)、雄烯二酮(androstenedione)等.天然與合成雄激素類物質(zhì)是一類典型的內(nèi)分泌干擾物[1-2].環(huán)境雄激素可干擾水生生物正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，引起雄性比例偏高、雌性出現(xiàn)雄性第二性征、卵精巢和卵黃蛋白原的誘導(dǎo)受抑制、生殖能力下降等[3-5]，也可引起哺乳動(dòng)物出現(xiàn)雄性化特征[6-8].17α-甲基睪酮(17α-methyltestosteron，MT)，又名甲基睪丸素或甲基睪丸酮，是一種人工合成的雄性激素，能促進(jìn)雄性性器官發(fā)育成熟和第二性征的形成和維持.實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，不同濃度的 MT 對(duì)不同魚類有不同的生物學(xué)效應(yīng)[9].低濃度 MT 可促進(jìn)魚類生長(zhǎng)，然而高濃度 MT 則導(dǎo)致魚類的畸形和死亡[10].對(duì)該化合物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究結(jié)果還顯示，MT 能改變魚類的性別，導(dǎo)致雌魚雄性化[11].在MT 對(duì)食蚊魚(Gambusiaaffinis)形態(tài)雄性的研究中顯示，MT 的雄激素效應(yīng)明顯，可導(dǎo)致雌魚在生長(zhǎng)發(fā)育過程中出現(xiàn)形態(tài)雄性化[12].對(duì)于已分化的性腺，外源激素可改變魚類個(gè)體的副性征、性行為及導(dǎo)致敗育或不育[13].在較低等的生物中，外源激素還可以引起性腺的再分化[14]，進(jìn)而改變個(gè)體的性別[15-16].

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我國(guó)特有的兩棲動(dòng)物，俗稱石蛙、石雞，分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)的山澗溪流中[17].棘胸蛙藥食兩用，據(jù)《本草綱目》[18]記載,石蛙具有較高的藥用價(jià)值，可以作為醫(yī)用輔助中藥，具有強(qiáng)身健體、降血壓、清解熱毒、降血脂等功效，素有“百蛙之王”的美名.棘胸蛙的養(yǎng)殖規(guī)模隨著市場(chǎng)需求逐步擴(kuò)大，棘胸蛙對(duì)養(yǎng)殖條件、生活環(huán)境等要求較高，同時(shí)也受到種源及技術(shù)等限制，近年內(nèi)難以形成一定的生產(chǎn)規(guī)模[19].棘胸蛙存在兩性異形，雄體大于雌體[20].因而棘胸蛙的高效養(yǎng)殖模式及單性養(yǎng)殖技術(shù)在棘胸蛙生產(chǎn)中顯得尤為重要.本試驗(yàn)用不同劑量MT飼料飼喂棘胸蛙小蝌蚪，通過組織學(xué)方法觀察性腺變化，探討外源雄性激素對(duì)棘胸蛙生長(zhǎng)發(fā)育及性腺的影響，為棘胸蛙的單性養(yǎng)殖及規(guī)?；a(chǎn)提供理論及技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

棘胸蛙來自浙江金華綠谷清泉生態(tài)石蛙養(yǎng)殖場(chǎng)和建德市鑫泉金石蛙生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng).在棘胸蛙的繁殖季節(jié)(2014，2015年的4—9月)，將不同親本同一天產(chǎn)出的受精卵混合放到孵化箱中流水自然孵化，密度為1 000 卵粒/m3水體，培養(yǎng)溫度控制自然水溫(22～24 ℃)，觀察胚胎發(fā)育，蝌蚪孵出后帶回實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

17α-甲基睪酮購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，純度98%.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用乙醇噴霧法將MT溶解于95%乙醇，之后將溶有MT的酒精和在牛蛙蝌蚪飼料里，再將飼料放入40 ℃烘箱中烘干后投喂.設(shè)置10，30，50 mg/kg實(shí)驗(yàn)組和0 mg/kg對(duì)照組，對(duì)照組用不含MT的相同體積的95%乙醇來處理.每組隨機(jī)分得同一批次剛孵出蝌蚪100尾；蝌蚪每天定時(shí)定點(diǎn)投喂1次處理過的高蛋白牛蛙蝌蚪飼料，投喂量為蝌蚪體重的3%～5%，同時(shí)每隔5 d投喂1次植物性餌料(蒸熟的苦麻葉)，以增強(qiáng)蝌蚪的抵抗力，投飼相應(yīng)餌料至蝌蚪變態(tài)為止；實(shí)驗(yàn)期間，用吸水泵清除水槽底部的糞便和剩余飼料，每次吸出一半培養(yǎng)用水，再補(bǔ)充等量經(jīng)過充分曝氣的自來水，水溫控制在22～24 ℃.實(shí)驗(yàn)期間每組水體中放入增氧泵時(shí)刻增氧，并用凈水器形成循環(huán)流水，在養(yǎng)殖箱中放置1～2片瓦片遮陰，形成山澗流水環(huán)境來提高蝌蚪的生長(zhǎng)條件.

在飼養(yǎng)60 d時(shí)，各濃度組蝌蚪都無變態(tài)，此時(shí)測(cè)量各濃度組蝌蚪的體長(zhǎng)體重，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).自第1只蝌蚪開始變態(tài)后，每天定時(shí)記錄每組蝌蚪的變態(tài)情況.同時(shí)在實(shí)驗(yàn)期間，記錄每組蝌蚪的死亡、變態(tài)畸形等.

1.4 組織學(xué)分析

發(fā)育85 d的蝌蚪統(tǒng)計(jì)完實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，切去蝌蚪尾巴及透明口部，將軀干固定于FAA液中固定3～4 h，做常規(guī)石蠟切片，經(jīng)HE染色在生物顯微鏡下觀察照相.

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 MT對(duì)蝌蚪體重體長(zhǎng)的影響

各濃度組棘胸蛙蝌蚪飼喂60 d后都沒有變態(tài)的情況，但是體長(zhǎng)生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出與劑量相關(guān)的減少趨勢(shì).最高濃度組(50 mg/kg)體長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，其他濃度組體長(zhǎng)與對(duì)照組相比也顯著減少(P<0.05)(見表1).表明MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪的體長(zhǎng)有一定的抑制作用.體重同樣呈現(xiàn)出與劑量相關(guān)增長(zhǎng)率的減少趨勢(shì)(見表1)，但差異不顯著(P>0.05).

表1 MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪體重體長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01).

2.2 MT飼喂對(duì)蝌蚪發(fā)育時(shí)間的影響

與對(duì)照組相比，10,30 mg/kg處理組蝌蚪變態(tài)周期均沒有顯著變化(P>0.05)，只有50 mg/kg組蝌蚪變態(tài)周期顯著縮短(P<0.01)(見表2).表明高濃度MT激素效應(yīng)明顯，能加快蝌蚪的變態(tài)發(fā)育.

表2 MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪發(fā)育時(shí)間的影響

注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)據(jù)后大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01).

2.3 MT飼喂對(duì)蝌蚪成活率、變態(tài)率、畸形率的影響

統(tǒng)計(jì)各組棘胸蛙蝌蚪的成活率、變態(tài)率、畸形率(見表3).與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組蝌蚪的成活率顯著降低(P<0.01)，說明MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪有致死效應(yīng)；MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪的畸形率影響較大，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在極顯著性差異(P<0.01)，畸形表現(xiàn)為蝌蚪變態(tài)不完全，前肢殘缺或長(zhǎng)不出前肢，跳躍有障礙，變態(tài)成幼蛙后易死亡.與對(duì)照組相比，各濃度組對(duì)蝌蚪變態(tài)率沒有引起顯著差異(P>0.05).表明棘胸蛙蝌蚪的變態(tài)率不受MT影響.

表3 MT對(duì)棘胸蛙蝌蚪的成活率、變態(tài)率及畸形率的影響

2.4 MT飼喂對(duì)蝌蚪雌雄比例的影響

對(duì)同一變態(tài)時(shí)期蝌蚪的性腺進(jìn)行切片觀察，統(tǒng)計(jì)性腺切片發(fā)現(xiàn)，雄性率與MT濃度呈正相關(guān)趨勢(shì).為獲得最佳觀察視野和觀察效果，對(duì)性腺切片放大不同倍數(shù)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，除了正常性腺(見圖1)之外每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)中間形態(tài)性腺，表現(xiàn)為一邊精巢一邊卵巢或一個(gè)性腺上既有精原細(xì)胞又有卵原細(xì)胞(見圖2).10 mg/kg MT含量實(shí)驗(yàn)組雄性率為52.8%，切片有2只中間形態(tài)的性腺；30 mg/kg MT含量實(shí)驗(yàn)組，雄性率為62.0%，切片有4 只中間形態(tài)的性腺；其中最高濃度組雄性率達(dá)66.0%，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)，切片有5 只中間形態(tài)的性腺(見表4).其中圖中字母分別表示:Ac：腹腔；Da：背主動(dòng)脈；G：消化道；M：中腎；Md：中腎管；Mu：肌肉；O：卵巢；Oo：卵原細(xì)胞；PGC：原生殖細(xì)胞； Sp：脊柱；Sc：次生性腔；Sg：精原細(xì)胞；T：精巢；Vi：內(nèi)臟.

表4 MT對(duì)棘胸蛙性比的影響

(a)0 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大25倍的正常發(fā)育卵巢；(b)50 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大100倍的正常發(fā)育卵巢；(c)10 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大25倍的正常發(fā)育精巢；(d)0 mg/kg MT組完成變態(tài)幼蛙性腺橫切面，示放大100倍的正常發(fā)育精巢

圖1 蝌蚪正常性腺切片

(a)50 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大50倍一側(cè)性腺為精巢；另一側(cè)仍含有卵原細(xì)胞的精巢;(b)30 mg/kg MT組性腺橫切面，示放大200倍含有卵原細(xì)胞的精巢，性腔未消失

3 討 論

3.1 MT對(duì)棘胸蛙生長(zhǎng)發(fā)育的影響

激素誘導(dǎo)一直是激發(fā)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生長(zhǎng)潛能的重要方式.在魚類，激素存在抑制或促進(jìn)生長(zhǎng)兩種情況.據(jù)報(bào)道，睪酮能夠促進(jìn)雌性日本粗皮蛙卵巢向著精巢大小方向發(fā)展[21].本研究采用不同濃度MT飼喂棘胸蛙蝌蚪，導(dǎo)致蝌蚪體長(zhǎng)呈現(xiàn)與劑量相關(guān)的負(fù)增長(zhǎng)關(guān)系，體重沒有表現(xiàn)出明顯的差異.實(shí)驗(yàn)期間，高濃度組蝌蚪生長(zhǎng)速度加快，變態(tài)周期縮短，提前進(jìn)入變態(tài)期.表明高濃度MT能夠抑制蝌蚪的生長(zhǎng)速度，體重、體長(zhǎng)的減小所釋放的能量可能用于蝌蚪的快速生長(zhǎng)，使其快速完成變態(tài).

對(duì)魚類激素誘導(dǎo)性別轉(zhuǎn)化的研究顯示，性別逆轉(zhuǎn)的動(dòng)物其存活率普遍較低[22]，表明遺傳型與表現(xiàn)型不相同的物種很容易死亡.激素處理強(qiáng)度表現(xiàn)為激素的使用劑量和持續(xù)處理時(shí)間2個(gè)方面及二者的交互作用.激素誘導(dǎo)作用具有閾值，作用效果在閾值以內(nèi)時(shí)，沒有顯著影響力，當(dāng)激素處理強(qiáng)度超過這個(gè)閾值后就會(huì)導(dǎo)致魚類的成活率明顯降低[23].到目前為止，尚未有報(bào)道性激素處理導(dǎo)致成活率升高的現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)研究表明，MT可降低棘胸蛙蝌蚪的成活率，但各處理組的成活率的差異性不顯著，可能是MT濃度或處理時(shí)間沒有達(dá)到致死率最高的閾值.本實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，畸形率顯著增高.由于畸形的幼蛙不具備跳躍捕食的能力，一般都會(huì)在完全變態(tài)后幾天內(nèi)死亡，造成死亡率升高的原因與MT影響下畸形率升高有一定聯(lián)系.

3.2 MT對(duì)棘胸蛙性腺分化的影響

已有研究表明，外源激素MT除了可以促進(jìn)正常的性腺分化外，還可使性腺出現(xiàn)畸形，如精巢中出現(xiàn)卵巢腔、性腺導(dǎo)管發(fā)育不全或消失、卵巢與精巢組織出現(xiàn)在同一個(gè)體中(兼性魚)、性腺萎縮和生殖細(xì)胞退化或消失(不育魚)、性腺發(fā)育抑制等[24].有研究報(bào)道，不同含量MT對(duì)黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)雄性率影響不大，但每個(gè)含量組都有雙性魚的出現(xiàn)[25].在本實(shí)驗(yàn)中，MT也導(dǎo)致蝌蚪中有中間性腺的現(xiàn)象，同一蝌蚪中既有精巢又有卵巢，在10，30和50 mg/kg組，中間態(tài)個(gè)體均有出現(xiàn).中間態(tài)的蝌蚪的性腺可能正處于逆轉(zhuǎn)時(shí)期.MT 已被認(rèn)為是一種有效的性腺轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑，魚類在自然性逆轉(zhuǎn)發(fā)生之前的任何年齡階段用其處理均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)雄[26-27].本研究顯示，當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/kg時(shí)，其雄性率顯著升高，而低濃度MT組雄性率無顯著變化.表明高濃度MT可誘導(dǎo)棘胸蛙雄性化.

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