徐江民， 蔣玲歡， 沈晨輝， 胡瑚倩， 林 晗， 馬 路， 饒玉春

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

衰老是生物有機體發(fā)育的必經階段，也是一個高度程序化的過程，對植物來說，通過這個過程可將衰老葉片中營養(yǎng)物質分解并轉運至生長旺盛的果實或種子等.葉片是水稻(Oryzasativa. L)重要的源器官，其功能及生長進程對水稻產量與品質有重要的影響.葉片發(fā)生衰老時，細胞內自由基產生及清除的動態(tài)平衡被破壞，自由基不斷積累，從而加劇細胞膜脂過氧化，而作為細胞膜脂氧化產物的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量也會增加[1].此外葉片中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性不斷下降，導致水稻葉片對活性氧的清除能力降低，活性氧積累，使膜脂過氧化作用不斷加強，從而促進了衰老[2-3].葉綠體是光合作用的主要場所，一旦葉片衰老，葉綠素含量降低，葉片光合能力將顯著下降，直接影響植物的生長量[4].衰老還伴隨著抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量的減少、活性的降低，抗壞血酸、谷胱甘肽、甘露醇和類黃酮含量也會減少等一系列反應[5].

植物激素在調控葉片衰老的啟動及進程中發(fā)揮著重要的作用[6].其中，一般情況下脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸(salicylic acid，SA)和茉莉酸(jasmonates，JA)可以促進葉片的衰老，而通常可以抑制葉片衰老的植物激素有細胞分裂素(cytokinins，CTK)、生長素(auxins)和赤霉素(gibberellins，GA)，這表明葉片的衰老涉及一個復雜的激素調控網絡[7].脫落酸在植物生理代謝活動中有重要作用，可減輕環(huán)境脅迫對植物的傷害，調控植物衰老[8-9].脫落酸對水稻灌漿的抑制或促進作用與其作用時間、濃度有關，在灌漿初期，脫落酸對籽粒灌漿有促進作用，灌漿后期高濃度脫落酸對灌漿起抑制作用[10].水楊酸是一種植物小分子酚類物質，它能夠抑制植物中乙烯的合成，同時又能夠促進植物生長過程中SOD和過氧化物酶(POD)的活性，進而抑制脂膜過氧化[11-12].近期研究發(fā)現植物激素茉莉酸的自然突變更能闡明茉莉酸在水稻衰老中發(fā)揮的作用，證明了甲醇-茉莉酸共同作用與其表觀遺傳的調控對于水稻葉片的衰老起著重要的作用[13].細胞分裂素延緩葉片衰老的機理之一是負調控葉綠素相關基因的表達，誘導葉綠素分解酶的降解，從而增加葉綠素含量，以維持葉片正常的光合能力[14].生長素在植物的生長發(fā)育過程中能提高相關的酶活性，提高源器官光合作用合成同化物的速率，促進同化物運輸，提高庫容活性[15].在葉片衰老過程中，赤霉素活性成分含量逐漸變低，噴施赤霉素可以延緩葉片衰老進程，所以赤霉素被認為是一類延緩葉片衰老的激素[16-17].

本文以水稻常規(guī)品種日本晴NIP及其作為背景的早衰突變體esd1為試驗材料，通過在不同時期施加不同濃度的多種外源激素處理后，測定水稻葉片中葉綠素含量、MDA含量、SOD含量等指標的變化，研究外源激素噴施對水稻葉片衰老的影響，找到最適宜的外源激素處理的時期和濃度，觀察其各種生理指標的變化.以期為延緩水稻衰老、提高水稻產量和品質的調節(jié)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水稻常規(guī)粳稻品種日本晴(NIP)和由NIP經過EMS (ethylmethane sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘變得到的早衰突變體esd1作為本實驗的水稻材料.

1.2 方 法

1.2.1 水稻種子的萌發(fā)與培養(yǎng)

取各品種的水稻種子200 粒，將水稻種子進行表面消毒(70%乙醇溶液消毒10 min，10%次氯酸鈉溶液消毒30 min)，再用去離子水沖洗數次，置于水中浸種2 d，期間換水1次.再進行37 ℃培養(yǎng)箱浸種催芽48 h (用濕毛巾包裹，確保種子的濕度)，待催芽之后挑選露白一致的種子進行播種.

1.2.2 各種外源激素最適濃度的確立

對2個品種的水稻進行常規(guī)的水肥管理，在水稻長到三葉期時取長勢一致的植株，在大田條件下于7:00用濃度為0，0.05，0.10，0.50，1.00和2.00 μmol/L的外源SA進行噴施處理，同時用濃度為0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 μmol/L的外源獨角金內酯GR24也進行噴施葉片處理，在噴施激素后的0，6，12，24，36，48和72 h時分別剪取葉片測其SOD或葉綠素含量，比較不同濃度下2種水稻葉片中SOD或總葉綠素含量的相對變化率，確定最佳處理濃度.當水稻長到灌漿期時，選取長勢一致的植株，在大田條件下于7:00用外源生長素2,4-D、ABA、GA3和細胞分裂素KT-30分別進行噴施處理，2,4-D的處理濃度為0，50，200，300，400和500 μmol/L，ABA的處理濃度為0，10，30，50，100，200和400 mg/L，GA3的處理濃度為0，10，50，100和200 mg/L，KT-30的處理濃度為0，0.10，0.50，1.00，2.00和4.00 μg/L，在處理后的0，1，3，5和7 d時分別剪取葉片測其葉綠素a、葉綠素b或MDA含量.比較不同濃度下2種水稻生理指標的相對變化率，最顯著的處理濃度為最適處理濃度.

1.2.3 與衰老相關的生理指標測定

葉綠素含量測定的方法參照Arnon分光光度法[18]，MDA含量參照陳建勛等[19]的方法，采用硫代巴比妥酸比色法測定.SOD酶活測定參照Wang等[20]和李合生[21]的方法，即以SOD抑制NBT光化學還原50%所需酶量為一個酶活性單位進行測定.

2 結 果

2.1 外源赤霉素對水稻葉片中MDA含量影響

從圖1(a)和圖1(b)中可以看出，當GA3的濃度為0 mg/L時，7 d后esd1和NIP中水稻葉片MDA含量均上升.NIP葉片經不同濃度的GA3處理7 d后，與0 d相比,MDA的含量均有所下降，且隨濃度的增加，MDA的減少程度呈現出先上升后下降的趨勢；esd1的葉片經不同濃度的GA3處理7 d后，與1 d相比,MDA的含量均有所下降，下降趨勢與NIP一樣，但MDA的下降程度較NIP更為明顯.二者均在GA3濃度為50 mg/L時，下降程度最為明顯，下降率分別為60.2%和90.6%，可以推測此濃度為外源GA3處理NIP和esd1的最適濃度(見表1).與NIP相比，esd1在GA3濃度為50 mg/L處理時MDA的下降程度更大，因此，esd1表現出對外源GA3更為敏感.

表1 各外源激素處理水稻最適濃度的確定

2.2 外源生長素對水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)的影響

從圖1(c)和圖1(d)可知，在2,4-D的處理下，2種水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)均有不同程度的增加，且在相同濃度的處理下，除了300 μmol/L濃度組的處理，其余esd1組w(葉綠素a∶葉綠素b)增加明顯高于NIP，其中在50 μmol/L濃度的處理下，esd1w(葉綠素a∶葉綠素b)增加量達到最大，達127.5%.而在此濃度下，esd1與NIP的增加程度差異也達到最大，達118.2%.說明發(fā)生早衰的esd1對生長素更為敏感，同時也暗示2,4-D對水稻葉片的衰老有抑制作用.在300 μmol/L的處理濃度下，NIPw(葉綠素a∶葉綠素b)的增加最為明顯，達到了75.5%，增加程度大于esd1，esd1只增加了36.0%.本研究表明，2,4-D處理的最佳濃度為野生型NIP最適濃度為300 μmol/L，而esd1最適濃度為50 μmol/L(見表1).

圖1 多種外源激素處理下NIP和esd1生理指標的變化

2.3 外源獨角金內酯對水稻葉片中總葉綠素含量的影響

從圖1(e)和圖1(f)中可知，經GR24處理72 h后，esd1和NIP的總葉綠素含量變化均不是很明顯，但變化過程稍有區(qū)別.其中NIP噴施GR24后，72 h內總葉綠素含量呈“M”型變化.噴施不同濃度GR24 6 h后，NIP中總葉綠素含量均有一定程度的上升.而esd1噴施GR24后，72 h內總葉綠素含量呈“W”型變化，在噴施后第一個6 h內，esd1中總葉綠素含量會有一個較為明顯的下降過程，后又逐漸上升，在噴施24 h后出現一個較為緩和的下降過程，后又逐漸上升.其中，esd1在濃度為0.50 μmol/L的GR24作用下，總葉綠素含量下降幅度大.這些結果表明,esd1對GR24較為敏感.

2.4 外源細胞分裂素對水稻葉片中MDA含量的影響

從圖1(g)和圖1(h)中可知，NIP和esd1在未經過KT-30處理時，MDA含量變化趨勢不明顯.經過不同濃度的KT-30處理后，esd1所有組均呈下降趨勢，在0.1 μg/L濃度處理下，水稻葉片MDA值下降程度最大，達72.7%.NIP在不同濃度處理下，相對未處理的均有下降，但是下降幅度不大，其中處理濃度為0.1 μg/L時，MDA下降趨勢最大，達9%.總的來說，在經過KT-30處理后，水稻葉片的MDA值均出現了不同程度的下降.但是esd1的葉片MDA值下降程度較NIP更加明顯，而且處理時間超過5 d后上升趨勢也比NIP的慢.根據以上結果可知,NIP和esd1的最適處理濃度均為0.1 μg/L(見表1).同時表明,esd1對KT-30更為敏感.

2.5 外源脫落酸對水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)的影響

從圖1(i)和圖1(j)中可知，NIP葉片經濃度為30 mg/L的ABA處理時，效果最好，w(葉綠素a∶葉綠素b)呈上升趨勢，其余濃度處理的水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)雖呈下降趨勢，但下降趨勢逐漸減緩.esd1的水稻葉片中的w(葉綠素a∶葉綠素b)變化趨勢與NIP基本相同，但最適處理濃度為100 mg/L(見表1).總的來說，2組水稻經激素處理后，w(葉綠素a∶葉綠素b)下降減緩，但對NIP更為明顯，表明esd1對ABA低敏感.

2.6 外源水楊酸對水稻葉片中SOD活性的影響

從圖1(k)和圖1(l)中可知，經各濃度梯度SA處理，esd1水稻葉片的SOD值在前24 h內幾乎無明顯變化.大部分濃度的SA在處理24 h后，SOD值有小幅度的升高.且當處理濃度為2 μmol/L時,SOD變化最顯著，在處理后12 h內就有較明顯的升高，雖然在處理36 h后水稻葉片SOD值有一個明顯的下降過程，但在72 h后逐漸上升.NIP水稻葉片的SOD值在經SA處理后仍呈下降趨勢，但是在處理24 h后各組均呈上升趨勢，其中處理濃度為0.1 μmol/L的水稻葉片的SOD值上升趨勢最明顯，在處理12 h之后就有一個較明顯的上升，但發(fā)現esd1葉片中SOD值呈下降趨勢.因此，野生型NIP最適處理濃度為0.1 μmol/L，而esd1最適濃度為2 μmol/L(見表1).從各組SOD變化的程度分析，可以認為esd1對SA更加敏感.

3 討 論

植物的衰老是一個極其復雜的生物學過程，是植物生命周期中必然經歷的階段，除受遺傳因素調控外，外部環(huán)境因素也會影響其正常的生長發(fā)育.其中，植物激素在調控植物衰老的進程中起著很重要的作用，因此，對外源激素影響植物衰老機理的研究是不可或缺的.在本試驗中，通過不同濃度的多種外源激素噴施水稻葉片的方法，來探究外源激素在影響水稻生長發(fā)育的影響作用.這為植物激素在調控水稻葉片衰老的研究提供一定的參考價值.

本研究中，在未噴施GA3時水稻葉片的MDA含量隨著時間的推移而逐漸上升，而噴施GA3后對應品種的葉片內MDA含量總體呈下降趨勢，暗示了GA3能通過某些生化途徑來抑制水稻葉片中MDA的產生，從而延緩葉片衰老.與NIP相比，esd1表現出對GA3更敏感，推測esd1突變體影響了GA的信號傳導途徑.生長素對葉片衰老的調節(jié)作用通過應答和編碼生長素相應因子或吲哚乙酸蛋白來實現，生長素在葉片衰老過程中可以有效抑制衰老基因表達，從而維持細胞活性來延緩衰老[22].本研究通過噴施2,4-D可以提高水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)，esd1在低處理濃度下就表現出異常敏感反應，說明esd1對2,4-D更敏感.推測esd1突變體衰老相關基因的表達升高而表現出早衰表型，外源噴施2,4-D可以有效延緩衰老的發(fā)生.通過噴施KT-30來統(tǒng)計分析葉片中MDA含量的變化，結果發(fā)現在很低濃度處理下esd1突變體就表現出葉片中MDA含量急劇下降的敏感反應.推測這可能與esd1突變的分子機制有關，導致其對KT-30的敏感反應增強.在灌漿初期外源噴施不同濃度ABA，發(fā)現在低濃度處理下對w(葉綠素a∶葉綠素b)影響不大，在較高濃度下處理，發(fā)現NIP和esd1w(葉綠素a∶葉綠素b)呈下降趨勢，由此推斷，外源ABA能促進葉片的衰老，會推進庫源轉運的進程.在水稻三葉期時噴施SA，結果發(fā)現NIP和esd1的SOD含量均呈上升趨勢，但SOD變化趨勢與實驗預期存在差異，這可能是因為我們處理的水稻處于三葉期，胚中的營養(yǎng)物質充分，足以保證水稻生長到五葉期，因此葉片還未呈現出衰老狀態(tài)，SOD含量并不會產生特別明顯的變化.另外，本研究也進行了噴施GR24處理，發(fā)現與衰老相關的生理指標沒有太大的變化，這可能與噴施的時期有關.據陳小娟研究發(fā)現，獨腳金內酯位于生長素的下游，其作為第二信使，對水稻的衰老的調控需要較長一段時間來體現[23].由于受種種條件所限，我們所選的實驗周期較短，可能不足以體現獨腳金內酯對延緩水稻衰老所起的作用效果.然而考慮到外源激素對水稻葉片衰老作用的延緩具有時效性[24]，仍要經過大量的實驗才能得出合適的處理周期，并得到更令人滿意的結果.

整體上看，噴施外源激素對延緩水稻衰老具有一定的可行性效果，并且esd1對多種外源激素更為敏感.這些結論可以為水稻葉片發(fā)生早衰的品種延緩衰老提供理論支持.下一步筆者將通過分子水平上探究多種植物激素是如何參與調控植物葉片衰老的，分析esd1基因參與的信號通路，初步探明水稻早衰發(fā)生的分子機制和激素間的遺傳調控網絡.

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