毛楊毅，羅惠娣，王志武，趙 鵬，張冠武，李 俊，郭宏宇，張 麗，薛麗娜，黨文慶

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032）

幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)始于20世紀70年代初。 Worthington 等［1］對 5～6 周齡的羔羊注射 HCG，發(fā)現(xiàn)羔羊卵巢上大量卵泡開始發(fā)育；Trounson等［2］對10～16周齡青年羔羊的卵母細胞進行了研究，將卵母細胞在體外發(fā)育到囊胚。21世紀，科學家們對羔羊卵泡發(fā)育和體外受精技術(shù)進行了更深入的研究，現(xiàn)已利用幼畜超排技術(shù)獲得幼齡羊的大量卵母細胞，經(jīng)體外成熟、受精、胚胎發(fā)育等一系列孵育、培養(yǎng)過程后生產(chǎn)出“試管羊”［3-12］。但是，在幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系中，一直存在卵母細胞繼續(xù)發(fā)育能力差及卵母細胞質(zhì)成熟不充分的問題［13-14］。為此，研究者模仿體內(nèi)卵母細胞成熟環(huán)境條件，在成熟液中添加胎牛血清（FBS）、谷胱甘肽（GSH）、促卵泡素（FSH）、17β-雌二醇（17β-E2）、促黃體素（LH）、生長因子（IGF-1、FGF、EGF）及能量物質(zhì)等，試圖通過改進卵母細胞成熟液，達到提高幼齡羊卵母細胞的發(fā)育能力。韓巖等［15］進行了谷胱甘肽對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育影響的研究；曹忻等［16］進行了血管內(nèi)皮生長因子對體外成熟綿羊卵母細胞超微結(jié)構(gòu)變化影響的研究。但迄今為止，未見有關(guān)不同濃度β-巰基乙醇成熟液對幼齡羊的卵母細胞發(fā)育能力影響的研究報道。因此，本試驗進行了不同濃度β-巰基乙醇成熟液對6周齡杜泊羊的卵母細胞發(fā)育能力影響的研究，為優(yōu)化幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗時間和地點 試驗于2014年10月7—25日在山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物遺傳工程實驗室進行。

1.1.2 試驗羊 6只6周齡杜泊羊由晉中林山養(yǎng)殖合作社提供。

1.1.3 冷凍精液和發(fā)情羊血清（ESS） 杜泊羊冷凍精液和ESS自制。

1.1.4 主要激素、試劑及耗材 促黃體素（LH）、17β-雌二醇（17β-E2）、促卵泡素（FSH）及孕馬血清（PMSG），均購自北京綠欣農(nóng)牧科技有限公司；肝素鈉、牛血清白蛋白（BSA）、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）等為索來寶（Solarbio） 品牌，M199、Hepes、β-巰基乙醇、NaCl、CaCl2·2H2O、NaHCO3等為 SIGMA 品牌，圓底玻璃試管、離心管、培養(yǎng)皿等為Corning品牌，四孔培養(yǎng)板為Nunc品牌，均購自山西賽奧生物科技有限公司。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺（SW-CJ-2FD）、離心機（Sigma 3-16PK）、體視顯微系統(tǒng)（OLYMPUS SZX10）、研究級倒置顯微系統(tǒng)（OLYMPUS IX71）、二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO MCO-5AC）等均由山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物遺傳工程實驗室提供。

1.1.6 主要手術(shù)器械及用品 手術(shù)刀、手術(shù)剪、止血鉗、注射器、75%酒精、碘酒等均購自山西省醫(yī)療器材公司。

1.1.7 培養(yǎng)液 采卵液：M199（含20 mmol/L Hepes，2%ESS，10 mg/mL 肝素鈉）；對照組成熟液：M199（含 20%ESS，10 μg/mL FSH，10 μg/mL LH，1 μg/mL 17β-E2）；試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組成熟液：在對照成熟液的基礎(chǔ)上，分別含50、70、100 μmol/L 的 β-巰基乙醇；獲能液：合成輸卵管液（SOF）（含 20 μg/mL肝素鈉）；受精液：SOF液（含 2%ESS）；受精卵發(fā)育液：SOF液（含 8 mg/mL BSA，2%EAA，1%NEAA）。

1.2 方法

1.2.1 6周齡杜泊羊的激素誘導和卵母細胞采集 采用Kelly等［3］的羔羊激素誘導方法，不同之處是PMSG注射量為每只羊300～350 IU；采用白佳樺［7］的活體采集卵母細胞方法。

1.2.2 ESS制備 從發(fā)情1 d羊的頸靜脈采集血液，4℃冰箱靜置20 h左右，吸取血清，56℃水浴滅活30 min，用0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃冷凍保存。

1.2.3 凍精制作 將活力0.8以上杜泊羊精液用常規(guī)干冰冷凍法制作顆粒凍精。

1.2.4 精子獲能 采用白佳樺［7］的精子體外獲能方法。

1.2.5 卵母細胞成熟 采用白佳樺［7］的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的方法。不同之處是將采集的6只幼齡杜泊羊的A、B級COCs隨機分為4份，分別放入已在5%二氧化碳（38.5℃、飽和濕度）培養(yǎng)箱平衡2 h的四孔培養(yǎng)板孔中的對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組的成熟液里，礦物油覆蓋，繼續(xù)在5%二氧化碳培養(yǎng)箱里成熟培養(yǎng)24 h。

1.2.6 卵母細胞受精及受精卵培養(yǎng) 采用白佳樺［7］的卵母細胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的方法。卵母細胞和精子共同孵育24 h左右，在顯微鏡下觀察卵裂情況；再將受精卵移至受精卵發(fā)育液培養(yǎng)12 h左右統(tǒng)計卵裂率；繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，觀察受精卵發(fā)育情況并統(tǒng)計桑葚胚率或囊胚率。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel進行數(shù)據(jù)處理，χ2檢驗方法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼齡杜泊羊激素誘導效果

由表1可知，6只6周齡杜泊羊共采集卵丘-卵母細胞復合體（COCs）489.0 枚，平均 81.5枚/只，其中 A、B級COCs 460.0枚，平均76.7枚/只。

由圖1可以看出，促性腺激素誘導后幼齡杜泊羊卵巢體積增大、紅漲，上面密布充滿卵泡液的卵泡。

表1 6周齡杜泊羊獲得卵母細胞情況 枚/只

圖1 6周齡杜泊羊激素誘導后卵巢上卵泡

2.2 不同濃度β-巰基乙醇成熟液對卵母細胞發(fā)育的影響

460.0 枚A、B級卵母細胞分別在不同濃度（0、50、70、100 μmol/L）β-巰基乙醇的對照組、試驗Ⅰ、試驗Ⅱ和試驗Ⅲ組的成熟液中成熟后，經(jīng)體外受精孵育、受精卵發(fā)育培養(yǎng)等過程，卵母細胞的發(fā)育情況見表2及圖2～3。

由表2可知，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的卵裂率、囊胚率均比對照組高（P＞0.05），其順序為試驗Ⅲ組＞試驗Ⅱ組＞試驗Ⅰ組＞對照組，100 μmol/L β-巰基乙醇組卵母細胞的卵裂率和囊胚率分別比對照組增加6.09個百分點和9.57個百分點，且囊胚率增加幅度大于卵裂率。表明卵母細胞成熟液中添加β-巰基乙醇可以提高幼齡羊卵母細胞的卵裂率和囊胚率，尤其囊胚率提高幅度更大。β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢。

表2 不同濃度β-巰基乙醇成熟液卵母細胞發(fā)育情況

圖2 卵母細胞體外受精后的2～4細胞受精卵

圖3 卵母細胞體外受精后的囊胚

3 討論

幼畜胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)體系不僅直接影響卵母細胞成熟的程度和繼續(xù)發(fā)育的能力，而且直接影響幼畜胚胎體外生產(chǎn)的效率。白佳樺［7］、郭洪等［17］研究表明，在4～8周齡的蒙古羔羊、綿羔羊卵母細胞體外成熟液中添加100 μmol/L β-巰基乙醇，卵母細胞正常受精比例和囊胚率顯著提高，多精入卵比例明顯下降，且正常受精的比例與成年羊沒有顯著差異（P＞0.05）。權(quán)富生等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵母細胞的顆粒細胞培養(yǎng)液中添加β-巰基乙醇，能提高活細胞率，且活細胞率隨著β-巰基乙醇濃度的增大而增加，在濃度為25 μmol/L時活細胞率最高。舒見洪等［19］研究顯示，在牛卵母細胞培養(yǎng)液中，添加100 μmol/L的β-巰基乙醇可顯著提高牛體外受精后胚胎的囊胚率以及囊胚內(nèi)細胞團細胞數(shù)。蘭宗寶等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細胞成熟液中添加β-巰基乙醇，可以提高胞質(zhì)內(nèi)谷胱甘肽濃度，而給受精卵提供適宜的細胞內(nèi)條件，可防止氧化損傷，有助于胚胎發(fā)育到囊胚。本試驗表明，在6周齡杜泊羊的卵母細胞成熟液中添加（50、70、100 μmol/L）β-巰基乙醇，提高了卵裂率和囊胚率，尤其是囊胚率；試驗Ⅲ組（含100 μmol/L β-巰基乙醇）的卵裂率（65.22%）和囊胚率（21.74%）最高，β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢，且囊胚率增加幅度比卵裂率大，說明β-巰基乙醇有助于卵母細胞發(fā)育到囊胚。本研究結(jié)果與白佳樺［7］、郭洪等［17］、權(quán)富生等［18］、舒見洪等［19］、蘭宗寶等［20］的研究結(jié)果一致。其原因可能是β-巰基乙醇是一種低分子量的巰醇類化合物，能夠還原胱氨酸為半胱氨酸，半胱氨酸是合成谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的底物。GSH存在于身體的每一個細胞，具有抗氧化和解毒作用。在卵母細胞發(fā)育過程中，它通過自由巰醇基團（-SH）保護細胞發(fā)育、氨基酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)合成和DNA復制等過程中所需功能蛋白質(zhì)、酶不被氧化，消除活性氧自由基（ROS）對其繼續(xù)發(fā)育的阻滯或延遲作用，加速受精卵中精子解聚和原核形成，減少孤雌激活和多精子受精的發(fā)生，提高正常受精的比例和受精卵的發(fā)育能力，增加囊胚率。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，成熟液中添加一定量的β-巰基乙醇，能夠提高6周齡杜泊羊卵母細胞的發(fā)育能力和受精卵質(zhì)量，β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢。關(guān)于成熟液里β-巰基乙醇的最佳濃度，有待進一步研究。

［1］Worthinqton C A，Kennedy J P.Ovarian response to exogenous hormones in six week old lambs［J］.Aust J Biol Sci，1979，32（7）：91-95.

［2］Trounson A O，Willadsen S M，Moor R M.Reproductive function in prepubertal lambs：ovulation，embryo development and ovarian steroidogenesis［J］.J Reprod Fertil，1977，49：69-75.

［3］Kelly J M，Kleemann d O，Walker S K.Enhanced efficiency in the production of offspring from 4-to 8-week-old lambs［J］.Theriogenology,2005，63（7）：1876-1890.

［4］Kelly J M，Kleemann D O，Walker S K.The effect of nutrition during pregnancy on the in vitro production of embryos from resulting lambs［J］.Theriogenology,2005，63（7）：2020-2031.

［5］Gou K M，Guan H，Bai J H，et al.Field evaluation of juvenile in vitro embryo transfer（JIVET）in sheep［J］.Animal Reproduction Science,2009，112（3/4）：316-324.

［6］Bai J H，Hou J，Guan H，et al.Effect of 2-mercaptoethanol and cysteine supplementation during in vitro maturation on the developmental competence of oocytes from hormone-stimulated lambs ［J］.Theriogenology,2008，70（5）：758-764.

［7］白佳樺.性成熟前綿羊、牛JIVET技術(shù)研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2008.

［8］郭洪，萬鵬程，石文艷，等.不同品種綿羊超數(shù)排卵及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2012，44（10）：20-24.

［9］汪立芹，何宗霖，林嘉鵬，等.薩?？烁嵫蚵雅菡T導發(fā)育效果的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學學報，2015，20（4）：141-146.

［10］劉宗正，李和剛，程明，等.利用JIVET技術(shù)快速繁育薩福克羊的研究［J］.畜牧與飼料科學，2016，37（3）：1-3.

［11］馬世科，喬海生，馬利青，等.幼畜超數(shù)排卵及體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)在青海高原地區(qū)的應(yīng)用研究［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2015，45（2）：13-14.

［12］陳曉勇，田樹軍，桑潤滋，等.誘導幼羔卵泡發(fā)育及體外胚胎生產(chǎn)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2008，16（3）：456-460.

［13］郭洪，萬鵬程，代蓉，等.羔羊卵母細胞體外胚胎生產(chǎn)影響因素分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（19）：4726-4729.

［14］李運生，曹鴻國，劉亞，等.羔羊超數(shù)排卵與胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（11）：99-104.

［15］韓巖，尹多，張濤，等.谷胱甘肽對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育影響的研究進展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（3）：269-270.

［16］曹忻，趙有璋，羅海玲，等.血管內(nèi)皮生長因子對體外成熟綿羊卵母細胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2010，41（2）：167-173.

［17］郭洪，萬鵬程，石文艷，等.EGF和β-巰基乙醇對羔羊卵母細胞體外受精和體外發(fā)育的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（11）：6537-6540.

［18］權(quán)富生，劉琴，王麗，等.β-巰基乙醇和發(fā)情羊血清對牛顆粒細胞體外培養(yǎng)的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20（12）：22-25.

［19］舒建洪，張志鵬，李向臣，等.β-巰基乙醇對牛孤雌胚胎發(fā)育的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學學報，2008，36（12）：24-28.

［20］蘭宗寶，何若鋼，莫品方，等.β-巰基乙醇對豬卵母細胞體外受精及胚胎發(fā)育的影響［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2008，24（4）：202-203.