王 巍，方東輝，付茂忠，甘 佳，唐 慧，石 溢，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

基因組印記（Genomic imprinting），又稱為遺傳印記（Genetic imprinting），是指在配子期或合子期，來自親本（父源或母源）的等位基因或染色體發(fā)生特異性的修飾，導(dǎo)致不同親本來源等位基因具有不同表達(dá)活性的一種不遵從孟德爾定律的單親性特殊遺傳現(xiàn)象［1-2］。絕大多數(shù)的印記基因都是成簇存在的；在印記簇中的印記基因的表達(dá)或沉默是由印記控制區(qū)（Imprinting control regions，ICRs）通過順式作用來調(diào)控的［3］。ICRs實(shí)質(zhì)為一段差異性甲基化區(qū)域（Differentially methylated regions，DMRs），這種差異性甲基化一般是在生殖細(xì)胞中建立的，以調(diào)控整個(gè)印記基因簇的基因沉默情況［4］。因此，印記基因簇可以分為兩種，即在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中進(jìn)行修飾而產(chǎn)生的母源印記以及在精子發(fā)生過程中進(jìn)行修飾而產(chǎn)生的父源印記［5-6］。

普-威綜合征（Prader-Willi syndrome，PWS）和安吉爾曼綜合征（Angelman syndrome，AS）是兩種先天性的神經(jīng)行為發(fā)育異常綜合癥。這兩種疾病的臨床癥狀和遺傳形式雖不相同，但病因都與人類染色體15q11～13區(qū)域的母源性印記基因簇有關(guān)。PWS/AS基因簇包含

PWS和AS兩個(gè)亞區(qū)，其中PWS亞區(qū)又包含有5個(gè)父源表達(dá)的蛋白編碼基因，即MKRN3、MAGEL2、NDN、SNURF 和 SNRPN［7］。PWS/AS 基因簇的 ICRs區(qū)由 PWSIC和AC-IC兩部分組成；PWS-IC被定位于包括SNRPN的啟動(dòng)子和外顯子1的4.3 kb區(qū)域內(nèi)［8］，而AC-IC區(qū)則被定位于SNRPN基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游35 kb前的880 bp區(qū)域內(nèi)［9］。敲除父源性的PWS-IC區(qū)可致PWS亞區(qū)所有父源基因表達(dá)的沉默［10］。PWS/AS基因簇等母源印記區(qū)是良好的分子標(biāo)簽。應(yīng)用甲基化測序方法檢測克隆動(dòng)物早期胚胎中這些印記區(qū)的甲基化水平，并與體外受精胚胎進(jìn)行比較，可直觀地了解克隆胚中母源染色體的甲基化模式，也可為提高克隆胚胎的成功率提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

處于配子期（受精后8 h或激活后5 h）、S期、2-cell期、8-cell期和桑葚期的西門塔爾牛體外受精（IVF）胚胎和體細(xì)胞核移植（SCNT）胚胎每個(gè)時(shí)期各40枚，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 總DNA的亞硫酸鹽變性及DNA提取

按照全細(xì)胞亞硫酸鹽DNA甲基化修飾試劑盒（Epigentek）的操作說明，取20 μL的樣品進(jìn)行DNA的亞硫酸鹽變性及提取，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

以PWS/AS基因簇的ICR區(qū)為主要的分析對(duì)象，根據(jù)NCBI上公布的牛SNRPN基因序列（GenBank ID：NM_001079797）查找其啟動(dòng)子序列，使用methyl primer express software v1.0引物設(shè)計(jì)軟件分別在兩個(gè)基因的啟動(dòng)子內(nèi)選取一個(gè)CPG島設(shè)計(jì)引物，用于BSP測序。引物設(shè)計(jì)情況見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增片段在SNRPN基因啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)位置示意圖及引物設(shè)計(jì)

1.4 目標(biāo)片段的擴(kuò)增

參照天根生化科技（北京）有限公司MasterMix PCR試劑盒的使用說明，在2×25 μL及應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，53.6℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，38 個(gè)循環(huán)；72℃末端擴(kuò)增10 min。

1.5 目標(biāo)片段的克隆

用干凈的手術(shù)刀割下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入1.5 mL離心管中。采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），按照說明書操作進(jìn)行膠回收?；厥盏腄NA通過pMD19-T載體（大連寶生物公司）進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物均勻加入到30 μL的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；42℃水浴熱激45 s，然后立即冰上放置冰浴1 min；每管中加入900 μL的LB肉湯培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2 h，使細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)對(duì)抗生素的抗性；然后涂布于含Amp的LB瓊脂平板中，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.6 菌落PCR鑒定

挑選平板上的單個(gè)菌落，接種于含Amp的LB肉湯中培養(yǎng)過夜，用菌液作PCR模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。從SCNT和IVF胚胎5個(gè)發(fā)育階段菌落樣本中各挑選12～15個(gè)陽性克隆，送上海英俊公司進(jìn)行序列測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用BIQ甲基化分析軟件對(duì)重亞硫酸鹽測序結(jié)果分析，并對(duì)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±S表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，相同階段不同類型胚胎、相同胚胎不同階段的甲基化水平和甲基化位點(diǎn)比較采用兩因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在250 bp至500 bp之間接近250 bp處出現(xiàn)目的條帶，與目的片段的長度相符，見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 SNRPN基因啟動(dòng)子總體甲基化值測定

各個(gè)發(fā)育階段的IVF胚胎和SCNT胚胎中，SNRPN基因啟動(dòng)子的甲基化測序結(jié)果見表1。

由表1可知，SCNT胚胎發(fā)育時(shí)期PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平的變化模式為：S期甲基化水平顯著低于其他各時(shí)期（P＜0.05），且其他4個(gè)時(shí)期的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；IVF胚胎發(fā)育時(shí)期PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平的變化模式為：2-cell期甲基化水平顯著低于其他各時(shí)期（P＜0.05），且其他4個(gè)時(shí)期的甲基化水平差異也均不顯著（P＞0.05）。SCNT胚胎發(fā)育至2-cell期時(shí)，PWS/AS亞區(qū)ICR甲基化水平顯著高于IVF胚胎（P＜0.05）。

表1 PWS-IC亞區(qū)ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育期中的甲基化值

2.3 SNRPN啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)位點(diǎn)甲基化情況分析

如圖3所示，SNRPN轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)1 693 bp開始的258 bp序列中共檢測到5個(gè)甲基化位點(diǎn)。

圖3 SNRPN基因啟動(dòng)子的5個(gè)甲基化位點(diǎn)分布

圖4 SCNT和IVF胚胎各發(fā)育時(shí)期5個(gè)位點(diǎn)甲基化水平

由圖4-1可見，配子期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點(diǎn)1的甲基化水平顯著低于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-2可見，S期SCNT胚胎和IVF胚胎的PWS/AS亞區(qū)ICR中5個(gè)位點(diǎn)甲基化水平差異均不顯著（P ＞0.05）；由圖 4-3可見，2-cell期 SCNT胚胎 PWS/AS亞區(qū)ICR中位點(diǎn)1和位點(diǎn)5的甲基化水平均顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他3個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-4可見，8-cell期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點(diǎn)1的甲基化水平顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平差異均不顯著（P＞0.05）；由圖4-5可見，囊胚期SCNT胚胎PWS/AS亞區(qū)ICR中位點(diǎn)1的甲基化水平顯著高于IVF（P＜0.05），兩種胚胎其他4個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平差異也均不顯著（（P＞0.05）。因此，位點(diǎn)1和位點(diǎn)5為去甲基化抑制機(jī)制的易感位點(diǎn)。

3 討論

PWS/AS基因簇的ICR區(qū)表現(xiàn)為母源印記狀態(tài)，因此，其ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育過程中的甲基化變化模式可以反映母源染色體的甲基化模式［11］。該ICR印記區(qū)在IVF胚胎中的甲基化模式為2-cell期之前進(jìn)行去甲基化，并于8-cell期開始DNA甲基化的重建。該結(jié)果與前面的免疫熒光結(jié)果相吻合，與Fatima等［3］的試驗(yàn)結(jié)果吻合［3］。IVF 胚胎中 PWS/AS基因簇的 ICR 區(qū)（PWS-IC）在S期前去甲基化并不顯著（P＞0.05），發(fā)育到S期，DNA大量復(fù)制后才進(jìn)行了顯著的去甲基化（P＜0.05）。該檢測結(jié)果表明，母源基因的印記區(qū)段在S期之前先進(jìn)行微弱的主動(dòng)去甲基化，在S期DNA大量復(fù)制時(shí)進(jìn)行大規(guī)模的被動(dòng)去甲基化。該結(jié)論可以支持Chan、Goll和Morgan等的觀點(diǎn)［12］，但還有待更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。

SCNT胚胎PWS/AS基因簇的ICR區(qū)（PWS-IC）甲基化模式較IVF胚胎變化比較劇烈，在卵裂之前的SCNT胚胎中PWS/AS基因簇的ICR區(qū)的甲基化水平較IVF胚胎差異不顯著（P＞0.05），見表1。卵裂后SCNT的甲基化水平發(fā)生了極顯著的升高，表明母源DNA在S期至2-cell期的發(fā)育階段進(jìn)行了異常的甲基化重建，該結(jié)果證明了Dean等［13］的觀點(diǎn)，克隆胚胎甲基化過高的原因?yàn)檫^早地進(jìn)行了甲基化的重建。同時(shí)也提示在去核的卵母細(xì)胞中存在著大量過表達(dá)或功能得到增強(qiáng)的甲基化重建相關(guān)酶，影響基因組的正常去甲基化。超甲基化水平必定會(huì)影響ICR區(qū)對(duì)于整個(gè)基因簇的調(diào)控情況，從而對(duì)細(xì)胞分化、增殖、胚胎發(fā)育等產(chǎn)生重要關(guān)系［14］。McAllister等［15］研究已經(jīng)證實(shí)，SNRPN 基因印記的紊亂還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常。

4 結(jié)論

PWS-IC區(qū)域甲基化模式改變，導(dǎo)致了SCNT胚胎母源DNA的高甲基化；同時(shí)篩選出了2個(gè)去甲基化抑制機(jī)制的易感位點(diǎn)，即SNRPN啟動(dòng)子的1 693 bp開始的258 bp序列中的1號(hào)和5號(hào)位點(diǎn)。推測是母源DNA過早地進(jìn)行了甲基化的重建，造成了克隆胚胎的甲基化過高，建議在核移植過程中優(yōu)化卵母細(xì)胞的篩選機(jī)制和卵母細(xì)胞成熟機(jī)制。

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