孫媛媛，劉佳，富偉能

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽 110122； 2. 實驗動物部，沈陽 110001）

MYCT1是本課題組前期應(yīng)用定位克隆策略發(fā)現(xiàn)的與喉癌相關(guān)的致病基因，位于6q25，全長21 000 bp，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，mRNA序列長約1 006 bp［1］。MYCT1基因在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，如在多數(shù)實體瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，在白血病中卻發(fā)揮癌基因作用，提示MYCT1基因通過不同的信號通路發(fā)揮不同的功能［2-6］。然而，有關(guān)MYCT1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制仍不清楚，其相互作用蛋白質(zhì)的篩查和鑒定將有助于明確其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

本研究中擬通過構(gòu)建含有GST標(biāo)簽的MYCT1原核表達(dá)載體，獲得大量的MYCT1-GST融合蛋白，為MYCT1相互作用蛋白質(zhì)的篩查和鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

全血RNA 提取試劑盒 （美國Galen Biopharm公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、JM109菌株 （日本TaKaRa公司），pET28a （+） 載體 （中國上海吉凱基因公司） 、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ/ HindⅢ及PCR 相關(guān)試劑（日本TaKaRa 公司），無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒、BL21 （DE3） 菌株 （中國Tiangen公司），IPTG、瓊脂糖粉末、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、卡那霉素 （美國Sigma公司），小鼠源GST標(biāo)簽抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗 （中國Proteintech公司），ECL化學(xué)發(fā)光液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細(xì)菌蛋白提取試劑盒 （中國南京凱基公司） 。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體酶切和鑒定：將純化的pET28a （+） 質(zhì)粒應(yīng)用NcoⅠ/ HindⅢ雙酶切，并對載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。

1.2.2 目的片段的獲?。喝≌Ｈ诵迈r抗凝血，1 500 r/min離心10 min進(jìn)行血漿分離，將血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL無RNA酶離心管中，加500 mL TRIzol進(jìn)行總RNA提取。以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增目片段。引物序列如下：Forward，5’-AAGAAGGAGATATACCATGGTGTCCCCTATACT AGGTTATTGG- 3’；Reverse，5’- CGAGTGCGGCCGC AAGCTTTCAGGAATCTGGGAATGCCTTGATGATG -3’；CCATGG表示插入的NcoⅠ切酶位點，AAGCTT表示插入的HindⅢ內(nèi)切酶位點。按照試劑盒說明書配制PCR 反應(yīng)液，擴(kuò)增條件如下：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 8 min；4 ℃+∞。

1.2.3 MYCT1-GST表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收和純化目的條帶，與酶切后的pET28a （+） 空載體按1∶4比例混合，16℃連接過夜，并將連接產(chǎn)物加入含有100 μ L JM109感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化；將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入1 mL LB培養(yǎng)液，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h；將菌液涂布于含有卡納霉素的LB平板，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h；挑選單克隆菌落6～10個，放入2 mL含有卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)10～12 h，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，按照試劑盒說明書配制PCR 反應(yīng)液，擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃ +∞，引物序列：Forward，5’- GAAATCCAG CAAGTATATAGC- 3’；Reverse，5’-TGCTAGTTATT GCTCAGCGG-3’ 。

1.2.4 中量提取質(zhì)粒：將鑒定出的陽性轉(zhuǎn)化子接種于50 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，6 000 g離心收集菌體。按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA。

1.2.5 原核融合蛋白MYCT1-GST的純化和鑒定：將MYCT1-GST重組質(zhì)?；D(zhuǎn)BL21 （DE3） 菌株，挑取單個克隆進(jìn)行PCR鑒定。選取陽性克隆加入5 mL LB的10 mL試管里，37 ℃培養(yǎng)過夜。 將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500 mL LB的1L錐形瓶中，37 ℃，225 r/min培養(yǎng)至OD600≈1.0～1.5，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在37℃下培養(yǎng)8 h。6 000 g離心收集細(xì)菌體，加入20 mL細(xì)菌裂解液 （PBS 1%Triton-100 PMSF） ，吹打混勻，冰上超聲破碎至裂解液充分清涼，11 000 r/min，15 min，4 ℃離心分離上清。取50～70 μ L GST-瓊脂糖微球到EP管中，用800 μ L PBS 1%Triton-100潤洗1次，將提取的融合蛋白MYCT1-GST與之混勻，4 ℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h。PBS 1%Triton-100洗3次，PBS洗3次，離心收集瓊脂糖微球，加入40 μ L 5×上樣緩沖液溶解瓊脂糖微球上的蛋白，煮沸3 min，收集純化好的重組蛋白。

配置10% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量為20 μ L。連接電泳裝置，以恒電壓80 V進(jìn)行電泳。當(dāng)?shù)鞍譓arker進(jìn)入分離膠后，將電壓提至120 V，直至溴酚蘭泳至凝膠下端附近 （約1.5 h） ，關(guān)閉電源，停止電泳。200 mA電轉(zhuǎn)膜1 h，取出PVDF膜，放入封閉液中置于水平搖床上，室溫封閉1 h。加入一抗溶液，置于搖床上4 ℃雜交過夜，加入二抗溶液，室溫雜交1 h，ECL化學(xué)發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 載體酶切結(jié)果

提取純化pET28a （+） 質(zhì)粒 （圖1A） ，應(yīng)用NcoⅠ/HindⅢ雙酶切該質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到1條5 400 bp條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期相符 （圖1B） 與預(yù)期結(jié)果一致，提示酶切成功。

2.2 目的片段獲取

通過實時PCR實驗進(jìn)行擴(kuò)增MYCT1 CDS區(qū)，產(chǎn)物大小1 424 bp，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致，見圖2。

2.3 MYCT1-GST 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為919 bp，與預(yù)期結(jié)果一致 （圖3A） 。將鑒定出的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序，對測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，測序所得序列與目的基因MYCT1的CDS區(qū)完全一致 （圖3B） 。

圖1 pET28a （+） 空載體酶切結(jié)果Fig.1 Restriction digestion of the empty vector pET28a （+）

圖2 MYCT1目的片段獲取Fig.2 MYCT1 target fragment

2.4 融合蛋白MYCT1-GST的純化與鑒定

通過PCR方法檢測MYCT1-GST重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果顯示1～7號克隆均轉(zhuǎn)化成功 （圖4A） 。應(yīng)用GST標(biāo)簽抗體通過Western blotting實驗對融合蛋白MYCT1-GST進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示重組蛋白組 （M1-G）有融合蛋白MYCT1-GST表達(dá)而對照組只有GST蛋白表達(dá)，提示純化成功 （圖4B） 。

3 討論

蛋白質(zhì)是組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組分，也是行使功能的主要形式。在細(xì)胞中存在大量的蛋白通過與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體參與生命活動的調(diào)控［7-9］。因此，研究MYCT1相互作用蛋白將有助于揭示其在腫瘤中發(fā)揮的功能和參與的信號通路。

圖3 MYCT1-GST 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定Fig.3 Identification of MYCT1-GST clones

圖4 融合蛋白MYCT1-GST的獲得與鑒定Fig.4 Acquisition and identification of MYCT1-GST fusion protein

常用的相互作用蛋白研究方法包括GST-pull down、Co-IP、噬菌體展示技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微成像技術(shù)以及酵母雙雜交技術(shù)等，其中GST-pull down技術(shù)實驗周期短，操作步驟簡便，比較容易純化得到大量的重組蛋白，且能夠提供2個蛋白質(zhì)直接相互作用的有力證據(jù)［10-12］。因此GST-pull down技術(shù)不但可以作為研究蛋白質(zhì)相互作用的首選方案，同樣也可以作為那些通過了其他研究手段如免疫共沉淀，酵母雙雜交等方法篩選得到的相互作用對的再次鑒定。

本研究中，通過提取外周血RNA進(jìn)行實時PCR來獲取MYCT1模板，構(gòu)建至具有PT7啟動子的pET28a （+） 載體質(zhì)粒DNA中，并通過PCR和質(zhì)譜的方法對其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建了MYCT1-GST載體，并在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)了GST融合蛋白，進(jìn)一步應(yīng)用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，純化到了MYCT1-GST融合蛋白。MYCT1-GST載體的構(gòu)建為研究MYCT1奠定了基礎(chǔ)，對進(jìn)一步研究其參與的信號通路及在腫瘤中的分子作用機(jī)制具有重要意義。

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