時(shí) 良，崔亞洲，韓金祥

1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062 2山東省罕見(jiàn)疾病防治協(xié)會(huì)，濟(jì)南 250062

罕見(jiàn)病通常是指患病率低但卻嚴(yán)重威脅生命的疾病。罕見(jiàn)病的定義在立法和政策上有所不同，通常以疾病發(fā)生率或患病率作為標(biāo)準(zhǔn)或臨界值。根據(jù)流行病學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院估計(jì)世界各地大約有7000種罕見(jiàn)病。中國(guó)常用世界衛(wèi)生組織對(duì)于罕見(jiàn)病的定義，即患病率低于0.65‰～1‰，然而，這些定義有一個(gè)相對(duì)寬泛的范圍。目前，對(duì)于中國(guó)罕見(jiàn)病的定義尚未統(tǒng)一[1]。盡管如此，中國(guó)作為人口大國(guó)，罕見(jiàn)病患者人群龐大，很多罕見(jiàn)病發(fā)病原因未知，且無(wú)有效根治手段，因此基于分子機(jī)制的研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義。

超過(guò)80%的罕見(jiàn)病與遺傳密切相關(guān)[2]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)可以產(chǎn)生疾病特異性iPSCs，進(jìn)而分化為與疾病相關(guān)的功能細(xì)胞用于構(gòu)建疾病模型，體外再現(xiàn)疾病表型、模擬遺傳學(xué)變化和病理過(guò)程，在此基礎(chǔ)上研究發(fā)病機(jī)制、篩選安全有效的藥物、替換患病的細(xì)胞或組織等。最重要的是，iPSCs技術(shù)不像胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)研究一樣飽受倫理學(xué)爭(zhēng)議和免疫排斥的困擾，廣大研究者基于此項(xiàng)技術(shù)已成功建立多種罕見(jiàn)病模型，并進(jìn)行了深入研究。本文主要討論了iPSCs技術(shù)應(yīng)用于罕見(jiàn)病疾病模型的建立及其在藥物篩選、細(xì)胞治療方面的應(yīng)用。

1 利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)建立罕見(jiàn)病疾病模型的優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)罕見(jiàn)病病因和病理生理機(jī)制研究往往依賴于原代或患者來(lái)源的永生化細(xì)胞系。雖然原始細(xì)胞類型很容易從血液或組織活檢中獲得，但與疾病相關(guān)的細(xì)胞類型如涉及大腦或心臟的細(xì)胞不易獲得，也不可能無(wú)限期增殖。此外，永生化細(xì)胞系隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)往往不能準(zhǔn)確反映原代細(xì)胞的狀態(tài)，限制了其在功能研究中的可靠性。同樣，動(dòng)物模型雖然是體內(nèi)研究不可替代的工具，但動(dòng)物和人類之間有相當(dāng)多的解剖學(xué)、胚胎學(xué)和代謝差異，如最常用的動(dòng)物模型小鼠與人類在心臟大小和靜息心率等方面均不同[3]；又如將轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用于阿爾茨海默病的研究中，由于人類和小鼠神經(jīng)細(xì)胞間的種屬差異造成大量神經(jīng)元缺失，因而無(wú)法準(zhǔn)確再現(xiàn)人的病理學(xué)過(guò)程[4]，成為基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)的最大障礙。因此，迫切需要建立人類疾病模型來(lái)彌補(bǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中使用動(dòng)物模型的缺陷。

人iPSCs技術(shù)的誕生為建立疾病模型提供了更多選擇。人iPSCs與ESCs高度相似，如可顯示ESCs樣的細(xì)胞形態(tài)、表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物、擁有相似的基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)狀態(tài)且具有體內(nèi)外分化成三胚層的能力[5- 6]。多種易獲得的供體細(xì)胞可重編程為人iPSCs(表1)，其可分化為各種功能細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等較難從患者身上直接獲取的疾病相關(guān)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs中殘存對(duì)供體細(xì)胞的表觀記憶，影響了iPSCs下游分化[7- 8]。但在眾多研究中，同時(shí)用人ESCs與iPSCs建立疾病模型可在體外得到相似的表型，證明了iPSCs技術(shù)用于建立疾病模型的可行性[9]。為了iPSCs的后期應(yīng)用，重編程方法不斷改進(jìn)，可采用安全高效、非病毒整合的方法(表2)。

在既往罕見(jiàn)病研究中，將患者特異性的iPSCs或功能細(xì)胞與健康人進(jìn)行比較，然而由于細(xì)胞來(lái)自不同個(gè)體，擁有不同的遺傳背景和基因表達(dá)水平，在一定程度上會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能會(huì)影響后期臨床應(yīng)用。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，借助于基因打靶技術(shù)修正缺陷的基因產(chǎn)生遺傳學(xué)匹配的對(duì)照細(xì)胞用于建立疾病模型，避免細(xì)胞系不同帶來(lái)的遺傳背景差異或偶然性結(jié)果[36- 37]。由于罕見(jiàn)病患者分布分散，不易獲取供體細(xì)胞，iPSCs結(jié)合基因編輯技術(shù)亦可為研究不易獲得的罕見(jiàn)病或基因型開(kāi)辟新的途徑。利用CRISPR/Cas9基因編輯工具能有效引入特定的突變位點(diǎn)，僅影響某個(gè)基因的一個(gè)副本，即患者的iPSCs僅在特定位點(diǎn)與正常對(duì)照組iPSCs不同，由此可獲得攜帶致病基因的iPSCs[38- 39]。

表 1 產(chǎn)生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多種供體來(lái)源

表 2 采用非病毒整合方法獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

K：KLF4；L：LIN28；M：c-MYC；O：OCT4；S：SOX2

iPSCs技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)對(duì)于研究表型差異較小的散發(fā)性或自發(fā)性疾病尤為重要[40]。常用兩種分析方法來(lái)避免除目的基因外的基因多樣性干擾，在疾病特異性iPSCs中修正疾病相關(guān)基因或在野生型iPSCs中引入致病突變[41]。研究人員利用這種方式建立了C1型尼曼匹克癥疾病模型，與對(duì)照組相比，疾病特異性iPSCs分化而來(lái)的肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出疾病相關(guān)缺陷，比如膽固醇積累和異常的細(xì)胞自噬現(xiàn)象，通過(guò)修正突變基因NPC1,修復(fù)了上述缺陷[42]，因此iPSCs技術(shù)為罕見(jiàn)病研究開(kāi)辟了新的途徑。隨著iPSCs技術(shù)的不斷發(fā)展，患者特異性iPSCs的獲取將更加規(guī)范化和規(guī)?；?，疾病模型會(huì)成為一種有效的工具，為新藥篩選、個(gè)性化再生醫(yī)療方案的制定另辟蹊徑。

2 基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞罕見(jiàn)病疾病模型的建立及機(jī)制研究

細(xì)胞重編程可產(chǎn)生基于iPSCs的罕見(jiàn)病疾病模型，從根本上推動(dòng)了對(duì)罕見(jiàn)病病理生理學(xué)和發(fā)病機(jī)制的深入理解，尤其是先前不易獲得的細(xì)胞或組織如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等；另外，iPSCs結(jié)合基因編輯技術(shù)，可解決罕見(jiàn)病患者樣本難獲得問(wèn)題。迄今為止，絕大多數(shù)疾病模型針對(duì)以孟德?tīng)栠z傳方式導(dǎo)致的病例而建立，但仍有很多疾病是偶發(fā)性或由多個(gè)位點(diǎn)基因的多態(tài)性導(dǎo)致。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞系等傳統(tǒng)建模方法極具挑戰(zhàn)性，而iPSCs技術(shù)可解決這一難題，即便有多個(gè)未知突變，疾病特異性iPSCs攜帶患者遺傳背景仍可再現(xiàn)病理表型，并在此基礎(chǔ)上探究疾病發(fā)生的機(jī)制。最近研究者利用iPSCs技術(shù)成功建立了多種罕見(jiàn)病疾病模型，并發(fā)現(xiàn)了其重要機(jī)制或靶點(diǎn)(表3)。

2.1 單基因罕見(jiàn)病

單基因突變?cè)斐傻募膊》Q為單基因病，單基因缺陷引起的新生兒患病率通常小于0.1‰，因而絕大多數(shù)屬于罕見(jiàn)病。iPSCs技術(shù)被廣泛應(yīng)用于建立先天突變的單基因罕見(jiàn)病模型，研究發(fā)現(xiàn)多種單基因疾病來(lái)源的iPSCs通過(guò)合適的下游分化方法得到疾病相關(guān)細(xì)胞類型，可在體外真實(shí)地模擬疾病病理學(xué)過(guò)程[62- 63]。通過(guò)iPSCs技術(shù)可建立單基因罕見(jiàn)病疾病模型，例如與神經(jīng)損傷有關(guān)的疾病(弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、C1型尼曼匹克癥、柯凱因綜合征等)，采用適宜的下游分化方法可得到疾病相關(guān)功能細(xì)胞，深入探究疾病發(fā)病機(jī)制[64- 67]。隨著iPSCs技術(shù)不斷發(fā)展，關(guān)于神經(jīng)發(fā)育障礙罕見(jiàn)病，最近研究者發(fā)現(xiàn)了一種更加高效的建模方法，從尿液收集到獲得神經(jīng)亞型僅需75 d[68]。

脊髓性肌萎縮癥是早發(fā)性罕見(jiàn)病，由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1突變導(dǎo)致，將患者特異性iPSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞用于模型建立[62]。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1突變導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衰退和肌肉萎縮變性。Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥患者通常在出生6個(gè)月內(nèi)表現(xiàn)出癥狀，隨著病情加重， 2歲時(shí)患兒死亡[69]。最初的iPSCs疾病模型，將Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥患者成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSCs分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[62]。從患者特異性iPSCs分化而來(lái)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與正常組相比存活能力降低。這項(xiàng)研究結(jié)果表明，患者來(lái)源的iPSCs可用于早發(fā)性單基因罕見(jiàn)病模型建立。

表 3 利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)建立的罕見(jiàn)病疾病模型

2.2 多基因罕見(jiàn)病

在染色體區(qū)域的缺失或重復(fù)稱為多基因病,復(fù)雜罕見(jiàn)病通常涉及多個(gè)或未知的異?；?。如自閉癥因表型和病因異質(zhì)性，建立細(xì)胞模型或動(dòng)物模型存在很大困難，因而揭示潛在的遺傳學(xué)、病理生理學(xué)機(jī)制具有很大挑戰(zhàn)。iPSCs技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)于理解復(fù)雜或散發(fā)性罕見(jiàn)病帶來(lái)了新的希望[70]，研究人員假設(shè)自閉癥患者中增多的腦體積和神經(jīng)元數(shù)量可能是神經(jīng)祖細(xì)胞增殖率增加的結(jié)果[71]，于是將患者特異性iPSCs分化為神經(jīng)祖細(xì)胞，患者的神經(jīng)祖細(xì)胞比正常組增殖速度快，與假設(shè)一致。神經(jīng)元?jiǎng)t表現(xiàn)出異常神經(jīng)發(fā)生和突觸減少，導(dǎo)致神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能缺陷。在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)祖細(xì)胞是受到嚴(yán)格調(diào)控的，如果異常增殖會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)久性分化異常和缺陷，將導(dǎo)致自閉癥的發(fā)生。第一型類胰島素生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor 1，IGF- 1)是一種自然產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)大腦發(fā)育和可塑性至關(guān)重要[72- 73]。研究人員發(fā)現(xiàn)IGF- 1可改善神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常，目前正處于臨床試驗(yàn)階段。

2.3 遲發(fā)性罕見(jiàn)病

相比于早發(fā)疾病，細(xì)胞的老化程度是遲發(fā)疾病病理學(xué)研究的重要因素，建立遲發(fā)性罕見(jiàn)病模型更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)閕PSCs的特點(diǎn)是具有早期胚胎的基因表達(dá)程序[74]。成功建模的重要方法是人工誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老[75- 76]。具體方法如下：(1)氧化應(yīng)激：使用MG- 132和吡唑醚菌酯等化合物，通過(guò)靶向線粒體的功能或蛋白質(zhì)降解途徑，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞衰老[77- 78]；(2)早衰蛋白：由核纖層蛋白截短后產(chǎn)生，可導(dǎo)致過(guò)早老化[75]。

最近發(fā)現(xiàn)的一種更具生理學(xué)意義的方法是采用小分子抑制端粒酶活性，其顯示了衰老的經(jīng)典特征，包括DNA損傷、活性氧增加，酪氨酸羥化酶的下調(diào)[79]。早衰綜合癥的iPSCs模型，如哈欽森-吉爾福德早衰綜合癥，不僅成功地模擬了高速分化和衰老的干細(xì)胞，而且也促進(jìn)了與年齡有關(guān)的標(biāo)志物應(yīng)用于更普遍的遲發(fā)性疾病如帕金森病研究[80]。

迄今為止，多種疾病的建模方案是基于單一的功能細(xì)胞。然而，對(duì)于很多疾病而言，不止一種功能細(xì)胞能準(zhǔn)確模擬疾病發(fā)生，如自閉癥建模，使用的是患者特異性神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。除此之外，為了更精確地再現(xiàn)疾病表型，需將不同類型的細(xì)胞共培養(yǎng)以研究細(xì)胞間的相互作用，如3D組織培養(yǎng)技術(shù)。從傳統(tǒng)的二維分化培養(yǎng)方法逐步發(fā)展為空間模擬人類組織或器官的交互作用。目前采用老鼠和人的組織干細(xì)胞或多能干細(xì)胞可產(chǎn)生多種器官，包括大腦、視網(wǎng)膜、腸道、腎臟、肝臟、肺、胃[81]。人iPSCs分化形成的組織因與內(nèi)源性細(xì)胞組織或器官結(jié)構(gòu)相似，而被廣泛應(yīng)用于模擬人類生理和發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞間相互作用。以組織形式存在的多種細(xì)胞比單獨(dú)分化得來(lái)的細(xì)胞功能上更加成熟，主要原因是存在細(xì)胞間的通訊，比如3D結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。目前已被用于模擬人類器官形成和疾病病理過(guò)程，檢驗(yàn)可用于治療的化合物或進(jìn)行細(xì)胞移植[82- 84]。3D組織培養(yǎng)技術(shù)有待發(fā)掘更加標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)條件和胞外基質(zhì)，高效地再現(xiàn)組織系統(tǒng)，將更適用于建立精準(zhǔn)疾病模型，進(jìn)而篩選新藥，促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)發(fā)展[85]。

3 基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞罕見(jiàn)病模型的應(yīng)用

iPSCs技術(shù)除了上述提到的建立罕見(jiàn)病模型，在發(fā)病機(jī)制和功能上進(jìn)行深入探究外，在藥物篩選、臨床治療等方面亦具有廣泛應(yīng)用。在有效疾病模型的基礎(chǔ)上，探究罕見(jiàn)病的病理生理學(xué)進(jìn)程，利用功能細(xì)胞篩選新型藥物，可推進(jìn)細(xì)胞或組織治療等再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，達(dá)到干細(xì)胞研究的最終目的。結(jié)合基因編輯技術(shù)，具體應(yīng)用流程如圖1所示，重編程罕見(jiàn)病患者的體細(xì)胞，誘導(dǎo)得到患者特異性iPSCs，結(jié)合基因編輯工具修正患病基因得到同型對(duì)照組，兩組細(xì)胞系均分化產(chǎn)生大量的功能細(xì)胞，在體外再現(xiàn)疾病表型，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物、篩選安全有效的藥物、替換患病的細(xì)胞或組織。這種定制化的治療方法可以避免免疫排斥和倫理學(xué)爭(zhēng)議。

3.1 藥物篩選

罕見(jiàn)病的藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程與普通疾病相似，需要大量資源，通常持續(xù)10～12年。952種中國(guó)住院患者可見(jiàn)的罕見(jiàn)病中，50種罕見(jiàn)病有相應(yīng)的孤兒藥在中國(guó)上市、獲得臨床批件或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，95%的罕見(jiàn)病目前尚無(wú)特效治療藥物，患者預(yù)后不佳，給社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因罕見(jiàn)病患者基數(shù)小而限制了全面的藥物試驗(yàn)，因而準(zhǔn)確測(cè)定患者藥物反應(yīng)和新陳代謝情況以降低不良反應(yīng)對(duì)罕見(jiàn)病患者的治療至關(guān)重要。考慮到整體市場(chǎng)份額不足，藥品開(kāi)發(fā)對(duì)制藥公司通常缺乏吸引力。直到1983年，《孤兒藥法案》才將美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的罕見(jiàn)病藥物份額提高至35%左右[2]?；趇PSCs的罕見(jiàn)病模型為發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)病可用藥物帶來(lái)了新的希望。家族性自主神經(jīng)功能障礙是單基因遺傳的早發(fā)性疾病，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞系，由IKBKAP編碼核因子抑制劑κB激酶復(fù)合物相關(guān)蛋白突變引起，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)缺陷和小纖維感覺(jué)神經(jīng)元功能障礙。在iPSCs模型的基礎(chǔ)上，分選并純化自主神經(jīng)元的神經(jīng)嵴細(xì)胞前體。研究小組檢測(cè)了6912個(gè)小分子化合物，發(fā)現(xiàn)8個(gè)化合物可恢復(fù)IKBKAP的表達(dá)，其中SKF- 86466可改善異常剪接[86]。這是使用基于人iPSCs疾病模型進(jìn)行高通量藥物篩選的第一個(gè)研究成果。

圖1誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)用于罕見(jiàn)病研究流程圖

疾病特異性iPSCs的另一個(gè)應(yīng)用是藥物重新定位，即在現(xiàn)有的已被批準(zhǔn)用于特定疾病的藥物中，找到其在其他疾病中新的應(yīng)用。研究α- 1抗胰蛋白酶缺乏癥的學(xué)者，從iPSCs分化得到肝細(xì)胞，利用已建立的臨床化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選了3131種臨床批準(zhǔn)的化合物(2800種藥物已被美國(guó)FDA/國(guó)外同行批準(zhǔn)或已進(jìn)入第二階段臨床試驗(yàn))，確定5種可改善該疾病表型的臨床藥物，繞過(guò)臨床前和臨床研究早期階段，直接作為臨床療法迅速進(jìn)行臨床試驗(yàn)[87]。軟骨發(fā)育不全由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3突變導(dǎo)致，日本京都大學(xué)研究人員成功獲得軟骨發(fā)育不全患者的iPSCs，并在體外再現(xiàn)了異常的軟骨形成過(guò)程；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)大量化合物篩選，研究者驚喜地發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可明顯恢復(fù)骨骼生長(zhǎng)，改善軟骨發(fā)育不全的癥狀[88]。他汀類藥物因有降低膽固醇的功效而被廣泛用于治療心血管疾病，如果臨床試驗(yàn)成功，將意味著擴(kuò)大了他汀類藥物的適用范圍。已批準(zhǔn)的藥物被確定可治療其他疾病并可在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估，而無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間的臨床前開(kāi)發(fā)。此外，由于這些藥物的作用靶點(diǎn)已知(如激酶抑制劑或蛋白酶)，有助于其在新的疾病中確定新的藥物靶點(diǎn)和治療方法。

通過(guò)以上研究，證明了與使用永生化細(xì)胞系和動(dòng)物模型相比，患者特異性iPSCs分化得到的疾病相關(guān)細(xì)胞更能準(zhǔn)確反映藥物的療效。此外，已批準(zhǔn)的藥物通過(guò)iPSCs罕見(jiàn)病模型可發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)癥。

3.2 藥物毒性試驗(yàn)

新藥開(kāi)發(fā)需要高額的經(jīng)費(fèi)，主要用于臨床試驗(yàn)后期出現(xiàn)的無(wú)法預(yù)測(cè)的副作用[89]。然而，iPSCs模型能有效預(yù)測(cè)候選藥物可能引起嚴(yán)重副作用，從而使候選藥物在后期毒性試驗(yàn)中失敗率大大降低。例如，西沙必利原本用于治療胃食管反流病，因?qū)π呐K有毒性而退出市場(chǎng)。研究人員將遺傳性長(zhǎng)QT綜合征、家族性肥厚性心肌病、家族性擴(kuò)張型心肌病患者的iPSCs分化為心肌細(xì)胞，這些心肌細(xì)胞再現(xiàn)了疾病表型如電生理功能障礙，在此基礎(chǔ)上用已知化合物包括西沙必利檢測(cè)對(duì)心臟毒性的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)患者來(lái)源的心肌細(xì)胞比正常組對(duì)西沙必利導(dǎo)致的異常更加敏感[90]。鑒于多種藥物因?qū)θ梭w產(chǎn)生副作用而被撤出市場(chǎng)，可能是當(dāng)前不全面的評(píng)估方法導(dǎo)致，iPSCs模型可進(jìn)一步證實(shí)和補(bǔ)充。

3.3 細(xì)胞治療

利用iPSCs技術(shù)促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)(內(nèi)源再生過(guò)程或細(xì)胞移植后替代受損組織)的發(fā)展引起了人們極大興趣。2014年Takahashi研究小組進(jìn)行了第一次iPSCs臨床試驗(yàn)，其將老年性黃斑變性患者自身iPSCs來(lái)源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行自體移植治療，治療結(jié)果為陽(yáng)性，阻止黃斑變性并改善了患者的視力[91]，雖然由于第2個(gè)患者iPSCs與供體成纖維細(xì)胞相比，存在3個(gè)單核苷酸變異和3個(gè)拷貝數(shù)變異而終止了下一步移植，但預(yù)計(jì)會(huì)重新開(kāi)始細(xì)胞治療[92]?；颉⒈碛^遺傳、染色體的變化往往是由iPSCs體外培養(yǎng)導(dǎo)致[93]，目前尚不完全清楚這些突變是否由重編程過(guò)程引起。盡管目前干細(xì)胞移植存在局限性，但其為罕見(jiàn)病治療開(kāi)辟了新的道路，而人類干細(xì)胞治療罕見(jiàn)病的臨床試驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)始[94]。

利用iPSCs技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞治療具有很多優(yōu)勢(shì)：(1)iPSCs能夠自我更新，可獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，隨后在體外可分化成任何類型的細(xì)胞；(2)iPSCs來(lái)源于患者自身供體細(xì)胞，避免尋找與組織相容性抗原兼容的細(xì)胞供體和使用免疫抑制劑。

然而，將iPSCs技術(shù)真正用于人類細(xì)胞治療，仍有很多困難需要克服：(1)iPSCs的致瘤性[95]，為確保最終分化得到的細(xì)胞中不含未分化的iPSCs，研究人員發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑可進(jìn)行篩選，使未分化的iPSCs死亡而不影響分化的細(xì)胞，降低了致瘤風(fēng)險(xiǎn)[96]。(2)由于iPSCs在體外培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致異常核型和拷貝數(shù)變異[97]，因此，在投入臨床治療前，需仔細(xì)排查iPSCs來(lái)源的細(xì)胞是否存在潛在的遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定以確保其純度、質(zhì)量和無(wú)菌。人類iPSCs平臺(tái)與基因編輯、3D組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可讓iPSCs技術(shù)為以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法提供更強(qiáng)大的細(xì)胞資源。

4 總結(jié)與展望

罕見(jiàn)病嚴(yán)重影響人類健康，相關(guān)研究已引起全球重視。盡管如此，罕見(jiàn)病仍然面臨著難診斷、難治療的挑戰(zhàn)，并發(fā)癥的存在亦增加了其診治難度。為了推動(dòng)中國(guó)罕見(jiàn)病政策的制定、深入發(fā)現(xiàn)遺傳機(jī)制、提升臨床診療水平，2016年“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究”重點(diǎn)專項(xiàng)“罕見(jiàn)病臨床隊(duì)列研究”的重要內(nèi)容即是建立全國(guó)統(tǒng)一的罕見(jiàn)病注冊(cè)登記系統(tǒng)，完善可共享的臨床隊(duì)列和樣本庫(kù)，整合臨床診療信息，進(jìn)而建立可開(kāi)展預(yù)后研究的隨訪數(shù)據(jù)庫(kù)體系?；诖?，2017年3月1日山東省罕見(jiàn)病注冊(cè)登記系統(tǒng)正式上線，目前已注冊(cè)罕見(jiàn)病病例850例。在十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“罕見(jiàn)病臨床隊(duì)列研究項(xiàng)目”的指導(dǎo)下，建立的中國(guó)國(guó)家罕見(jiàn)病注冊(cè)體系，將為中國(guó)罕見(jiàn)病精準(zhǔn)診斷與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供強(qiáng)大動(dòng)力。

在此平臺(tái)的支撐下，采用人的疾病模型來(lái)模擬這些復(fù)雜、多樣的癥狀，可更深入剖析發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的治療方法。iPSCs技術(shù)在罕見(jiàn)病建模方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并成功建立了單基因、多基因、遲發(fā)性罕見(jiàn)病疾病模型，該模型已成為藥物篩選、藥物毒性研究、個(gè)性化細(xì)胞治療的有效工具，推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。隨著高通量測(cè)序、基因編輯技術(shù)和小分子篩選技術(shù)的突破，與這些技術(shù)結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)罕見(jiàn)病的治療干預(yù)措施，將為罕見(jiàn)病患者的診治帶來(lái)前所未有的希望。

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