劉 暢，徐英春，宋紅梅，楊文航，楊啟文，劉亞麗，郭莉娜，劉文靜， 趙 穎，竇紅濤，王 瑤，王 賀，趙玉沛，孫宏莉

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100005 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 2檢驗科 3基本外科，北京 100730

傳統(tǒng)分枝桿菌實驗室診斷方法主要為分枝桿菌培養(yǎng)和涂片抗酸染色，近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，熒光PCR技術(shù)已廣泛應用于分枝桿菌的檢測。如何快速合理地檢測分枝桿菌成為實驗室檢測的主要問題。本研究對北京協(xié)和醫(yī)院連續(xù)3年分枝桿菌實驗室檢測情況進行回顧性分析，探討比較3種方法在醫(yī)院中的應用價值，為臨床醫(yī)生快速送檢提供參考。

1 材料和方法

1.1 標本來源

回顧性分析2013年1月至2015年12月北京協(xié)和醫(yī)院實驗室分枝桿菌檢測數(shù)據(jù)，剔除同種標本類型的重復送檢標本，多次送檢結(jié)果一次陽性即視為陽性。共10 326份培養(yǎng)、25 269份涂片抗酸染色、5949份PCR-熒光探針法檢測標本納入本研究，主要包括外周血、呼吸道標本、無菌體液、組織標本等類型。

1.2 實驗室檢測方法

1.2.1 分枝桿菌培養(yǎng)

分枝桿菌羅氏培養(yǎng)：液化標本加無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)至約45 ml，離心15 min，倒掉上清液，添加1～3 ml PBS以中和PH至6.8，取0.5 ml接種至羅氏培養(yǎng)管，35 ℃孵育，前2周每周觀察2次，以后每周觀察1次。

全自動分枝桿菌培養(yǎng)：按照MGIT 960全自動分枝桿菌液基培養(yǎng)檢測系統(tǒng)(BD,美國)規(guī)定進行[1]。

1.2.2 涂片抗酸染色

涂片抗酸染色采用金胺(O)染色初篩，對可疑陽性標本進行萋尼染色[2種染液均購自珠海貝索(BASO)生物技術(shù)有限公司]，染色后鏡檢確認。

1.2.3 PCR-熒光探針法

試劑盒購自博奧生物有限公司。標本液化處理后使用核酸提取儀(Extractor 36)進行DNA提取，PCR擴增儀(RT-cyclerTM236基因擴增儀)擴增，條件設(shè)置：37 ℃ 300 s，94 ℃ 180 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，50 ℃ 10 s。Ct值<40為陽性[2]。

1.3 觀察指標

分析3年間培養(yǎng)、涂片抗酸染色和PCR-熒光探針法的呼吸道、無菌體液、組織等標本的送檢量和陽性標本檢出率；以分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標準，計算涂片抗酸染色法和PCR-熒光探針法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，3年間陽性標本檢出率比較采用卡方檢驗。涂片抗酸染色法和PCR-熒光探針法的診斷價值比較采用配對McNemar卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌培養(yǎng)送檢標本種類、數(shù)量及檢出率

2013至2015年全院分枝桿菌培養(yǎng)送檢標本數(shù)量呈逐年上升趨勢。其中MGIT 960全自動分枝桿菌液基培養(yǎng)檢測標本8863份，羅氏培養(yǎng)標本1463份。標本種類以血液標本和呼吸道標本中的痰標本較多，分別占總標本量的31.4%(3244/10 326)和24.1%(2491/10 326)，其次為無菌體液(胸水、尿液、腦脊液和腹水)和組織標本(淋巴結(jié)活檢和肺組織)。不同標本類型分枝桿菌檢出率有所不同，其中呼吸道標本中的氣管支氣管吸取物(10.1%)和痰(9.8%)檢出率較高，其次為胸水(6.6%)和腹水(6.8%)。各年度送檢標本總體分枝桿菌檢出率相近(5.5%～5.7%)，其中淋巴結(jié)活檢和肺活檢標本檢出率有所升高，其他標本的檢出率無明顯變化。3年間總標本檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

2.2 涂片抗酸染色送檢標本種類、數(shù)量及檢出率

分枝桿菌涂片抗酸染色送檢標本數(shù)亦呈逐年上升趨勢，標本數(shù)量為培養(yǎng)的2.4倍。以痰標本最多，占總標本量的40.3%(10 196/25 269)，其次為毛刷，占14.9%(3754/25 269)。陽性標本以呼吸道標本(痰、毛刷、氣管支氣管吸取物和支氣管肺泡灌洗液)為主，其中氣管支氣管吸取物檢出率較高，為3.8%。無菌體液中菌量相對較少，造成檢出困難，檢出率低，胸水和腹水3年檢出率均為0。分泌物(16.9%)和膿液(11.2%)的檢出率最高。3年間總標本檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

2.3 PCR-熒光探針法送檢標本種類、數(shù)量及檢出率

PCR-熒光探針法檢測結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸是2013年本院檢驗科新開展的項目，3年間送檢結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸標本數(shù)為5949份，其中405份標本分離出結(jié)核分枝桿菌，124份標本分離出非結(jié)核分枝桿菌。標本數(shù)量以痰和氣管支氣管吸取物最多，分別占總標本數(shù)量的40.4%(2403/5949)和22.8%(1359/5949)。標本種類以呼吸道標本(痰、氣管支氣管吸取物和支氣管肺泡灌洗液)為主，其次為無菌體液(胸水、尿液、腦脊液和腹水)。陽性標本檢出率以膿液最高(20.6%)，其次為呼吸道標本中的氣管支氣管吸取物(12.3%)和淋巴結(jié)活檢(11.2%)。3年間總標本檢出率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

表 1 2013-2015年分枝桿菌培養(yǎng)送檢標本種類、 數(shù)量及檢出率

2013至2015年，PCR-熒光探針法陽性標本總檢出率(8.9%)明顯高于培養(yǎng)(5.6%)和涂片抗酸染色(1.9%)(P<0.05)。

2.4 實驗室分枝桿菌檢測方法診斷價值比較

以培養(yǎng)結(jié)果為金標準，對所有同時采用培養(yǎng)、涂片抗酸染色和PCR-熒光探針法檢測的3349份標本的檢測結(jié)果進行分析。涂片抗酸染色的敏感度較低，在26.6%～40.3%之間波動，特異度、陰性預測值和陽性預測值無明顯變化。3年內(nèi)250份涂片抗酸染色陰性標本培養(yǎng)出了分枝桿菌，隨著標本量的上升，涂片抗酸染色陰性但培養(yǎng)陽性的標本量也逐年上升(表4)。

2013至2015年3年總體數(shù)據(jù)顯示，PCR-熒光探針法的敏感度為40.3%～44.4%，特異度為92.8%～96.6%(表5)。

表 2 2013-2015年分枝桿菌抗酸染色送檢標本種類、 數(shù)量及檢出率

表 3 2013-2015年分枝桿菌PCR-熒光探針法送檢 標本種類、數(shù)量及檢出率

表 4 2013-2015年涂片抗酸染色法檢測分枝桿菌的 評價指標比較

比較涂片抗酸染色及PCR-熒光探針法檢測的實驗室診斷價值， PCR-熒光探針法的敏感度高于涂片抗酸染色(42.9%比31.3%，P<0.05)，特異度低于涂片抗酸染色(95.2%比97.4%，P<0.05)，陽性預測值、陰性預測值和準確性差異均無統(tǒng)計學意義。

表 5 2013-2015年P(guān)CR-熒光探針法檢測分枝 桿菌評價指標比較

3 討論

目前，分枝桿菌檢測實驗室方法包括分枝桿菌培養(yǎng)、涂片抗酸染色和PCR-熒光探針法。涂片抗酸染色用金胺(O)染色初篩，對可疑陽性標本進行萋尼染色確診。涂片抗酸染色操作簡便快速，成本低，但敏感度低，含菌量達104才能檢出。顯微鏡觀察要求檢驗人員具備一定的經(jīng)驗，且由于人工操作及取樣的不確定性，存在一定漏診率。一般臨床要求痰標本連續(xù)送檢3次以提高涂片檢出率[3]。分枝桿菌培養(yǎng)包括改良羅氏培養(yǎng)和液體培養(yǎng)(如BD MGIT 960液基培養(yǎng))。改良羅氏培養(yǎng)需要4～6周，時間較長且需定期觀察，不利于患者的管理和治療[4]。目前，BD MGIT 960液基培養(yǎng)是國內(nèi)外公認的新的分枝桿菌實驗室診斷“金標準”，8～14 d 可獲知結(jié)果，是一種更加標準化的技術(shù)[5- 7]。PCR-熒光探針技術(shù)因其簡單快速、全封閉擴增、重復性好等優(yōu)點并通過特異度引物和探針技術(shù)保障了實驗的準確性，2.5 h即可完成一個反應，對于陽性結(jié)果可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，補充了細菌學檢測的不足，其缺點是結(jié)果易受環(huán)境污染而呈假陽性，且不能判斷標本中是否為活菌[2]。

本研究分析比較了北京協(xié)和醫(yī)院2013至2015年間3種分枝桿菌檢測方法，臨床分枝桿菌實驗室檢測的標本送檢量逐年上升。涂片抗酸染色送檢標本數(shù)量最多，為培養(yǎng)的2.4倍，但其陽性標本檢出率較低，僅為1.9%，且3年間檢出率無明顯變化。以培養(yǎng)為金標準，涂片抗酸染色敏感度較低(31.3%)，即漏檢標本較多；特異度較高為97.4%，高于PCR-熒光探針法的95.2%(P<0.05)。PCR-熒光探針法分枝桿菌總檢出率(8.9%)高于涂片抗酸染色(1.9%)和培養(yǎng)(5.6%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。2015年P(guān)CR-熒光探針法陽性標本檢出率略有下降，可能原因為送檢PCR-熒光探針法的標本總量增多，而陽性標本數(shù)并未增加，其敏感度為42.9%，高于涂片法31.3%(P<0.05)。

涂片抗酸染色和PCR-熒光探針法檢測的陽性預測值均較低，分別為59.7%和52.2%，推測陽性預測值低可能原因有標本污染或標本中細菌繁殖導致假陽性或作為“金標準”的培養(yǎng)法敏感度較低[8]，此時應結(jié)合臨床癥狀進行判斷。

分枝桿菌培養(yǎng)為實驗室診斷的“金標準”，但檢測周期長。涂片抗酸染色簡便快捷，但陽性樣本檢出率和敏感度低。PCR-熒光探針檢測作為新型的分子檢測技術(shù)，與培養(yǎng)相比檢測周期明顯縮短，與涂片抗酸染色相比，具有較高的檢測敏感度，對于陽性結(jié)果可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，直接診斷結(jié)核病，在實驗室分枝桿菌屬的檢測中具有重要價值[9- 10]。

本研究的局限性：(1)本文為回顧性研究，可能存在一定的信息偏倚。(2)在培養(yǎng)數(shù)據(jù)分析時，本文將羅氏培養(yǎng)與MGIT 960全自動分枝桿菌液基培養(yǎng)數(shù)合在一起進行分析，且MGIT 960全自動分枝桿菌液基培養(yǎng)所占比例逐年上升，可能會存在混雜偏倚，對結(jié)果的判斷產(chǎn)生影響。(3)本研究僅對實驗室檢測方法進行了對比分析，未結(jié)合臨床診斷信息，未能對比實驗室和臨床診斷的差異性。

參 考 文 獻

[1] 張濤，呂純芳，盧留珠，等.BACTEC MGIT960系統(tǒng)快速培養(yǎng)分枝桿菌的效果評價[J]. 臨床肺科雜志，2011，16：717- 718.

[2] 郭莉娜, 徐英春, 孫宏莉, 等. PCR-熒光探針法快速診斷分枝桿菌屬感染臨床應用研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志,2015, 25:4811- 4813.

[3] 劉家云, 郝曉柯. 結(jié)核病實驗室診斷方法新進展[J]. 臨床檢驗雜志, 2013, 31:115- 117.

[4] 陳建波, 黃同花, 陳郁筠,等. 結(jié)核病3種實驗診斷方法比較與分枝桿菌耐藥性分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2012, 33:420- 421.

[5] Gallo JF, Jmw P, Saraceni CP, et al. Evaluation of the BACTEC MGIT 960 system and the resazurin microtiter assay for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to second-line drugs[J]. J Microbiol Methods, 2017, 139:168- 171.

[6] Battaglioli T, Soto A, Agapito J, et al. Manual liquid culture on simple Middlebrook 7H9 or MGIT for the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis[J]. Trop Med Int Health,2014, 19:1500- 1503.

[7] Huang Z, Qin C, Du J, et al. Evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for the rapid detection of MDR-TB and XDR-TB in China: a prospective multicentre study[J]. J Antimicrob Chemother, 2015, 70:456.

[8] 張麗帆, 邊賽男, 劉曉清,等. HIV陰性結(jié)核分枝桿菌血流感染成年患者臨床及實驗室特征[J]. 協(xié)和醫(yī)學雜志, 2017, 8:161- 166.

[9] Zhang Q, Zhou C. Comparison of laboratory testing methods for the diagnosis of tuberculous pleurisy in China[J]. Scientific Reports, 2017, 7:4549.

[10] 黃麗美, 林健雄, 彭東東,等. 聯(lián)合檢測技術(shù)用于結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病快速診斷的研究[J]. 中國病原生物學雜志, 2015，7：638- 641.