唐波　張道華　張雪花等

摘要：將從江蘇地區(qū)篩選出的1株增殖性能穩(wěn)定豬源JEV JS01毒株作為疫苗，用毒株制備滅活疫苗進(jìn)行免疫原性研究。試驗采用經(jīng)過細(xì)胞傳代獲得JEV JS01病毒液（1×107.5 TCID50/mL），以甲醛滅活后加入油佐劑，制備豬源乙型腦炎滅活疫苗。腹腔免疫9～12 g小鼠，攻毒保護(hù)結(jié)果顯示對照組小鼠全部死亡，免疫組90%以上健活。分別肌肉注射免疫仔豬及后備母豬，不同時間采集血清測定JEV ELISA抗體。檢測結(jié)果顯示，免疫后試驗豬血清抗體效價較免疫前均有顯著提高，后備母豬免疫8個月后抗體仍全部為陽性，抗體水平與免疫劑量呈正相關(guān)性。試驗表明該豬源乙腦病毒JS01毒株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。

關(guān)鍵詞：豬源乙型腦炎病毒；免疫原性；滅活疫苗

中圖分類號： S855.99文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0306-02

收稿日期：2015-05-28

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（11）2047]；江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012370）。

作者簡介：唐波（1982—），男，江蘇海安人，碩士，助理研究員，主要從事動物分子病原學(xué)及免疫學(xué)研究。Tel：（025）84392058；E-mail：2005107058@163.com。

通信作者：張道華，研究員，主要從事動物分子病原學(xué)及免疫學(xué)研究。Tel：（025）84392058；E-mail：zhangdh2005@163.com。流行性乙型腦炎病是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）引起的一種人獸共患傳染病[1]。人感染后主要表現(xiàn)腦炎神經(jīng)癥狀，但并不傳播。豬乙型腦炎病主要表現(xiàn)為公豬睪丸炎、母豬繁殖障礙等，多數(shù)豬呈隱性感染并表現(xiàn)病毒血癥的形式[2]?；家倚湍X炎病以及隱性感染的豬在病毒血癥階段都可成為最主要的傳染源，在自然界總構(gòu)成豬→蚊→人的鏈?zhǔn)絺鞑3]。該病的流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，每年給我國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元[4]。鑒于感染乙型腦炎的豬是人類乙型腦炎的重要傳染源，因此豬乙型腦炎的防治在公共衛(wèi)生方面也具有極其重要的意義[5]。

目前防治豬乙型腦炎病最經(jīng)濟(jì)有效的方法仍是接種疫苗[6]。我國預(yù)防豬群流行性乙型腦炎與人乙腦防控應(yīng)用的是同一弱毒株SA14-14-2株弱毒活疫苗，雖然已證實該毒株在人類應(yīng)用的安全性和有效性[7～8]，但是在豬群中廣泛接種人用乙腦減毒活疫苗的合理性、潛在的危害性還是越來越引起人們關(guān)注。本研究用經(jīng)過傳代篩選獲得1株增殖性能穩(wěn)定的豬源JEV毒株作為疫苗候選株進(jìn)行相關(guān)免疫原性研究，為研制高效、安全的BHK-21傳代細(xì)胞系豬源乙型腦炎滅活疫苗打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及毒株

BHK-21 細(xì)胞系購買自ATCC，JEV JS01毒株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分離、鑒定和保存。

1.2主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清 （FBS） 購自 GIBCO公司；豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司；乙型腦炎弱毒活疫苗購自上海海利生物藥品有限公司。

1.3病毒培養(yǎng)及含量測定

將細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)80%的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)物，去生長液。按感染復(fù)數(shù)為0.2%～0.5%接種JEV-JS株F4代病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，35 ℃培養(yǎng)。當(dāng)顯微鏡下觀察到細(xì)胞達(dá)75% CPE（細(xì)胞病變）時，凍融收獲病毒液。96孔板測定病毒滴度，將病毒液用DMEM液作10倍系列稀釋，取10-1～10-7稀釋度分別接種，每孔接種量為0.1 mL，同時設(shè)立DMEM液陰性對照孔。35 ℃下培養(yǎng)，觀察CPE，計算TCID50。

1.4滅活疫苗的制備

在病毒液中加入終濃度達(dá)到0.1%甲醛，于37 ℃作用 48 h，其間每隔6 h攪拌或振搖1次，獲得滅活后的病毒液。將滅活后的病毒液進(jìn)行滅活檢驗，用DMEM液1 ∶10稀釋后，接種細(xì)胞同時設(shè)立陰性對照孔，37 ℃下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變（CPE）。盲傳3代，如果無細(xì)胞病變（CPE）則表明滅活完全。由滅菌的吐溫-80與滅活病毒液按體積比例4 ∶96混合均勻組成水相。按照體積比為3 ∶1將油相和水相進(jìn)行混合并乳化，制備滅活疫苗。

1.5JEV JS01免疫原性研究

1.5.1小鼠免疫原性試驗9～11 g清潔級健康小鼠90只，隨機(jī)分成9組，每組10只。1組為對照組，注射無菌PBS緩沖液；4組為弱毒活疫苗組，分別取弱毒活疫苗10-1～10-4 4個稀釋度腹腔注射0.1頭份/只；另外4組腹腔接種豬乙型腦炎滅活疫苗，接種劑量分別為0.1、0.05、0.025、 0.012 5 mL/只，間隔7 d后用同等劑量加強(qiáng)免疫1次；加強(qiáng)免疫7 d后用病毒含量為2×103 LD50/0.2 mL的JEV-JS01株病毒液進(jìn)行強(qiáng)毒腹腔接種攻擊。自攻毒之日起逐日觀察至14 d判定結(jié)果（3 d內(nèi)死亡不計）。

1.5.2仔豬免疫原性評價用豬乙型腦炎滅活疫苗肌肉注射40日齡健康仔豬，分0.5、1.0、2.0 mL/頭共3個劑量組，每組4頭；另設(shè)對照組3頭，注射生理鹽水2 mL/頭。免疫后1、2、3、4周分別采血分離血清，用豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清ELISA抗體的，D630 nm﹥0.32為陽性。

1.5.3后備母豬免疫期及抗體消長規(guī)律研究將健康易感后備母豬20頭進(jìn)行分組試驗，分為4組，每組5頭。其中1組為對照組，其他3組為免疫組。免疫組在配種前45 d肌注豬乙型腦炎滅活疫苗，接種劑量分別0.5、1.0、2.0 mL/頭，間隔2周后分別用同等劑量疫苗加強(qiáng)免疫1次。對照組，注射生理鹽水2 mL/頭。免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分別采血分離血清，用豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測ELISA抗體，D630 nm﹥0.32為陽性。

2結(jié)果

2.1病毒培養(yǎng)及滴度測定

病毒接種細(xì)胞72 h后（觀察CPE達(dá)75%時）凍融收獲病毒液，測定病毒滴度。用Karber氏法計算出乙腦病毒JS01株F5代病毒含量達(dá)到1×107.5TCID50/mL。

2.2小鼠免疫原性試驗

在第2次免疫后第7天攻毒，逐日觀察至第14天。攻毒后空白對照組的小鼠從第6天開始表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀逐漸全部死亡，活疫苗各劑量免疫組對小鼠的保護(hù)率均為100%（10/10），滅活疫苗各劑量組總健活率為92.5%。結(jié)果表明，該病毒制備的白油佐劑滅活疫苗也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，對小鼠的保護(hù)率高（表1）。

表1JEV JS01株攻擊免疫小鼠的保護(hù)率

組別免疫劑量保護(hù)率（%）空白對照0弱毒活疫苗10-110010-210010-310010-4100滅活疫苗0.1 mL1000.05 mL1000.025 mL900.012 5 mL80

2.3仔豬JEV ELISA抗體檢測結(jié)果

疫苗免疫仔豬后JEV ELISA抗體檢測結(jié)果表明，所有劑量組仔豬免疫后免疫1周抗體全部轉(zhuǎn)陽，隨后抗體效價逐步增高，免疫后2～4周抗體效價均維持較高水平（圖1）。表明該JEV JS01株對仔豬具有良好的免疫原性，能夠較好地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫作用，免疫后仔豬抗體產(chǎn)生快、效價高。

2.4后備母豬免疫期及抗體消長規(guī)律

免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分別采血分離血清測定抗體，結(jié)果見圖2。不同劑量組疫苗免疫后備母豬2周后ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽，第14天二次免疫后抗體水平均有大幅度的提升?？贵w效價在免疫后2周至6個月均能維持在較高的水平，免疫后8個月所有劑量組母豬抗體仍全部為陽性。該結(jié)果表明JEV JS01株具有較好的免疫原性，免疫后抗

體水平高且持續(xù)時間長。

3討論

一直以來我國對JEV 的研究大多集中在人源和蚊源株，對豬源性JEV的研究重視不夠，對豬源乙腦毒株相關(guān)免疫原性的研究很少。近年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從豬體中分離出多株乙腦病毒，關(guān)于豬源JEV的報道越來越多[9～10]。然而有研究表明，一些豬源性分離毒株在分子特征上更接近現(xiàn)行弱毒株SA14-14-2，進(jìn)化樹分析表明這些分離株與疫苗株的親緣關(guān)系更近，可能是疫苗株在自然界發(fā)生毒力返強(qiáng)或者是與其他毒株在豬體內(nèi)發(fā)生重組所致[11～12]。因此，加大對豬源乙型腦炎病毒滅活疫苗的開發(fā)研究，對解決乙腦減毒活疫苗在豬群中使用的潛在危害具有重大意義。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開展了豬源乙型腦炎病毒滅活疫苗的研究工作。喬進(jìn)平等應(yīng)用豬源乙腦病毒株GZ0409-31制備滅活疫苗免疫動物，結(jié)果表明該病毒制備的滅活疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)性抗體[13]。Yang等應(yīng)用豬源乙腦病毒KV1899制備滅活疫苗免疫母豬也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體[14]。良好的滅活疫苗需要有良好的抗原作為基礎(chǔ)才能使機(jī)體獲得最佳的保護(hù)性免疫。國內(nèi)目前尚無商品化的豬源乙腦滅活疫苗。本研究選用免疫原性良好的豬源乙腦病毒研究疫苗的免疫效力，為研制高效、安全的豬乙腦滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

本研究選用經(jīng)BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定JS01株豬源乙腦病毒作為疫苗用毒株，制備的滅活疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生很好的免疫應(yīng)答，對小鼠具有較高保護(hù)率。所有劑量組疫苗免疫仔豬后1周抗體全部轉(zhuǎn)陽，抗體產(chǎn)生快、效價高。后備母豬免疫后抗體效價在免疫后6個月均能維持在較高的水平，免疫后8個月所有劑量組抗體仍全部為陽性，抗體水平與免疫劑量呈正相關(guān)性。免疫試驗結(jié)果證明該JEV JS01株具有較好的免疫原性， 該病毒制備的滅活疫苗能夠刺激機(jī)體

產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體和長時間免疫應(yīng)答，可以用作豬源乙腦滅活疫苗用毒株。

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