周園紅 羅幼珍 周曉琳 劉強(qiáng)

[摘要] 目的 構(gòu)建Slug過表達(dá)的慢病毒載體，為探討Slug在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的影響提供前期基礎(chǔ)。 方法 從人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中獲得Slug基因片段，與Age Ⅰ/Nhe I酶切后成線性化的GV367載體連接，采用PCR及DNA測序的方式鑒定陽性克隆。將構(gòu)建的LV-Slug轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，采用熒光法檢測LV-Slug的病毒滴度。 結(jié)果 經(jīng)測序證實(shí)Slug基因已成功插入到病毒載體中，其病毒滴度為5×108 TU/mL。 結(jié)論 成功構(gòu)建了攜帶Slug過表達(dá)的慢病毒載體，為探討Slug在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的影響提供基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 信號轉(zhuǎn)錄因子Slug；慢病毒載體；構(gòu)建；腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R394 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0012-04

[Abstract] Objective To construct recombinant lentivirus with Slug gene for further exploring the effect of Slug in metastatic recurrence. Methods The Slug gene was acquired from the breast cancer cell MDA-MB-231 by PCR assay， which was then connected into linearized GV367 vector digested by Age Ⅰ/Nhe I enzyme. The positive clones were identified by PCR and sequencing analysis. The constructed lentiviral vectors with Slug gene were then transfered into 293T cell lines. The lentivirus titer was detected by the fluorescence method. Results The lentiviral vector with Slug gene was successfully constructed and obtained， the virus titer of which was 5×108 TU/mL. Conclusion The lentiviral with Slug gene are successfully constructed， which will provide the experimental foundation for further exploring the effect of Slug in metastatic recurrence.

[Key words] Signal transcription factor Slug； Lentivirus vector； Construction； Metastatic recurrence

Slug又稱為SNAI2，是鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員之一，主要參與胚胎發(fā)育以及腫瘤細(xì)胞侵襲遷移等惡性表型的調(diào)控[1-3]。Slug在多種類型的人類腫瘤組織中均有表達(dá)，并且其表達(dá)量與腫瘤低分化，腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。大量臨床危險(xiǎn)因素相關(guān)性分析表明，Slug表達(dá)增高是多種腫瘤轉(zhuǎn)移后復(fù)發(fā)的主要危險(xiǎn)因素[7- 8]，Slug可上調(diào)原發(fā)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，進(jìn)而啟動腫瘤細(xì)胞增殖[9]，提示Slug在腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要的作用，但目前機(jī)制尚不清楚。本研究構(gòu)建Slug過表達(dá)慢病毒載體（LV-Slug），為探索Slug基因在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

In-FusionTM PCR Cloning Kit購自clontech公司，PCR反應(yīng)試劑盒購自Takara公司，Restriction Endonuclease 購自NEB公司，Clon ExpressTM One Step Cloning Kit購自Vazyme公司，TOP10 competent cell購自Genechem公司， Lipofectamine 2000 購自Thermo公司，GV367載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體購自上海吉凱基因，引物由Gene Ray公司合成。

1.2 方法

1.2.1 獲得線性載體

載體：GV367；克隆位點(diǎn)：Age Ⅰ/NheI；反應(yīng)條件：37℃ 3 h。

1.2.2 獲得目的基因

從GeneBank上查找人Slug基因的序列，基因編號NM_003068。擴(kuò)增引物，上游引物：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCC ACATGCCGCGCTCCTTCCTGGTCAAG-3′，下游引物：5′-CACACATTCCACAGGCTAGTCAGTGTGCTACACAGCAGCCAG-3′。PCR的方式從MDA-MB-231細(xì)胞中從獲得目的片段。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建[10]

1.2.3.1 目的基因與線性化的載體交換 在冰水中配置反應(yīng)體系（表1），于37℃ 30 min后，冰水中5 min后立即轉(zhuǎn)化。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)化 將交換反應(yīng)產(chǎn)物（10 μL）與感受態(tài)細(xì)胞（100 μL）混勻后，冰水30 min，42℃ 90 s后冰水2 min，取1 mL加入500 μL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。取適量菌液均勻涂布在含有抗生素的平板上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3.3 陽性克隆PCR鑒定 挑取單個(gè)菌落至鑒定體系中（2×Taq Plus Master Mix 10 μL，上游和下游引物各0.5 μL，DdH2O 9.0 μL），混勻后采用PCR鑒定。上游引物：GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG，下游引物：CGTCGCCGTCCAGCTCG ACCAG。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s×22循環(huán)，72℃ 5 min。陽性克隆結(jié)果測序分析。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及慢病毒收獲[11]

①制備DNA轉(zhuǎn)染液：GV367載體20 μg、pHelper 1.0載體15 μg、pHelper 2.0載體10 μg、Lipofectamine 2000混勻后調(diào)整總體積為1 mL，室溫下孵育15 min；②將以上混合液滴加至無血清培養(yǎng)基預(yù)處理2 h的293T細(xì)胞中培養(yǎng)；③6 h后PBS清洗3次，常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

1.2.5 慢病毒濃縮與純化定

①轉(zhuǎn)染48 h后，收集293T細(xì)胞上清液（4000 g ×10 min ×4℃）；②0.45 μm濾器過濾上清液后進(jìn)行超速離心（50 000 g×2 h×4℃）；③棄上清液，用PBS重懸病毒沉淀，輕吹打混勻后分裝。

1.2.6 熒光法測定慢病毒滴度

①制備病毒梯度稀釋液；②取90 μL如上倍比稀釋的含病毒液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h；③完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。病毒滴度（BT=TU/mL）計(jì)算公式：TU/μL=熒光細(xì)胞數(shù)×V×稀釋倍數(shù)；V=每孔加入病毒稀釋液體積（μL），TU/Ml=TU/μL×1000。

2 結(jié)果

2.1 酶切載體獲得

GV367載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Age I/Nhe I切斷，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。見圖1。

2.2 Slug基因獲得

根據(jù)GenBank的Slug基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條帶大小約853 bp，與理論值一致。見圖2。

2.3 陽性克隆

2.3.1 陽性克隆

陽性克隆PCR產(chǎn)物條帶分子量約1396 bp，陰性轉(zhuǎn)化子條帶分子量約661 bp。見圖3。

2.3.2 陽性克隆測序

測序結(jié)果與目的基因序列完全一致。見圖4。

2.4 病毒滴度測定

隨機(jī)選擇3個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡觀察：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可見綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖5（封三）。經(jīng)熒光法測定，慢病毒滴度為5×108 TU/mL。

3 討論

慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)開展起來的基因治療載體，目前該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室及臨床前研究中得到廣泛使用[12-13]。

大量臨床危險(xiǎn)因素相關(guān)性分析表明，Slug表達(dá)增高是多種腫瘤轉(zhuǎn)移后復(fù)發(fā)的主要危險(xiǎn)因素[7-8]，提示Slug在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及腫瘤休眠細(xì)胞激活增殖中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)有研究結(jié)果也證實(shí)：體外誘導(dǎo)形成的休眠腫瘤細(xì)胞中的Slug表達(dá)水平明顯降低[14-15]，但Slug是否參與腫瘤休眠細(xì)胞的激活，目前尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)：下調(diào)Slug表達(dá)能抑制直腸癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，食管癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)，過度表達(dá)Slug基因可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力[4，16-18]。因此，有必要探討Slug對腫瘤復(fù)發(fā)的影響。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建含Slug基因的慢病毒載體，滴度為5×108 TU/mL，為后續(xù)進(jìn)一步探索Slug基因在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響打下基礎(chǔ)。

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