劉翼天 嵇波 蘇杭 葛云鵬 王丹 趙國楨 Reiko Sakurai

[摘要] 目的 觀察電針“足三里”穴對(duì)孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺功能、肺指數(shù)和肺組織形態(tài)學(xué)的影響。 方法 將20只成年SD雌鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組（S組）、生理鹽水加電針“足三里”組（S+ST36組）、尼古丁組（N組）、尼古丁加電針“足三里”組（N+ST36組），采用皮下注射尼古丁注射液[1 mg/（kg·d），100 μL]造模，從妊娠第6天至新生鼠出生后21 d，用動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測各組新生鼠肺功能，根據(jù)肺組織重量和體重計(jì)算各組新生鼠肺指數(shù)，采用HE染色法觀察各組新生鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 與S組比較，N組呼氣峰值（PEF）、肺動(dòng)脈順應(yīng)性（Cdyn）顯著降低（P < 0.05），氣道阻力（RL）顯著增高（P < 0.05），肺指數(shù)顯著降低（P < 0.05）；新生鼠肺組織中肺泡數(shù)明顯減少，肺泡體積增大，部分肺泡壁破裂相互融合。與N組比較，N+ST36組PEF、Cydn顯著升高（P < 0.05），RL顯著降低（P < 0.05），肺指數(shù)顯著升高（P < 0.05）；新生鼠肺組織中肺泡數(shù)量增多、肺泡面積減小和肺泡壁破裂融合情況減少。 結(jié)論 電針孕期和哺乳期尼古丁暴露大鼠“足三里”穴可能通過改善新生鼠肺功能、肺指數(shù)及肺組織形態(tài)學(xué)變化發(fā)揮對(duì)新生鼠肺發(fā)育的保護(hù)效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 孕期及哺乳期尼古丁暴露；足三里；肺指數(shù)；肺功能；肺組織形態(tài)學(xué)

[中圖分類號(hào)] R246.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（a）-00040-05

[Abstract] Objective To observe the effects of electroacupuncture at “Zusanli” points on lung function， lung index and lung morphology of neonatal rats exposed to nicotine during perinatal period. Methods Twenty adult female SD rats were divided into normal saline group （S group）， normal saline plus electroacupuncture at “Zusanli” group （S + ST36 group）， nicotine group （N group） and nicotine plus electroacupuncture at “Zusanli” group （N + ST36 group） by random number table. The model was established by subcutaneous injection of nicotine [1 mg/（kg·d）， 100 μL] from gestational day 6 to postnatal day 21. The lung function of neonatal rats was detected by animal lung function analysis system. The lung index was calculated according to the weight and weight of lung tissue， and the morphological changes of lung tissue in newborn rats were observed by HE staining. Results Compared with group S， the PEF and Cydn in group N were significantly decreased （P < 0.05）， RL was significantly increased （P < 0.05） and lung index was significantly decreased （P < 0.05）. The numbers of alveoli in group N decreased obviously， and the volume of alveoli increased and part of alveolar wall ruptured and fused with each other. Compared with group N， PEF and Cydn in group N + ST36 were significantly increased （P < 0.05）， RL was significantly decreased （P < 0.05） and lung index was significantly increased （P < 0.05）. The number of alveoli in group N + ST36 increased， and the volume of alveoli decreased and the rupture and fusion of alveolar wall were improved. Conclusion Electroacupuncture at “Zusanli” points can protect lung development by improving lung function， lung morphology and lung index of newborn rats exposed to nicotine during perinatal period.

[Key words] Perinatal nicotine exposure； Electroacupuncture； Lung function； Lung morphology； Lung index

《2012年中國吸煙危害健康報(bào)告》顯示，我國吸煙人群超過3億，而被動(dòng)吸煙人數(shù)多達(dá)7.4億，主要受害者是婦女和兒童，超過50%的育齡婦女遭受二手煙危害[1]。孕婦直接或被動(dòng)吸煙對(duì)胎兒及新生兒均可以誘發(fā)多方面的損傷，尤其對(duì)子代肺功能和結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生不良的影響[2-4]，對(duì)此人們常采用糖皮質(zhì)激素治療，但是其有效率受限和副作用等問題一直未得到解決[5-6]。因此，尋求一種安全、有效的治療方法一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。古籍和現(xiàn)代研究均認(rèn)為，針灸足三里穴能增強(qiáng)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)修復(fù)功能，可用于多系統(tǒng)疾病調(diào)治[7-9]，尤其發(fā)現(xiàn)針刺足三里穴具有良好的內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)可以調(diào)治呼吸系統(tǒng)疾病[10-12]。本研究借助孕期及哺乳期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）誘發(fā)新生鼠肺發(fā)育不良模型，觀察電針孕期及哺乳期大鼠“足三里”穴后新生鼠肺功能、肺指數(shù)及肺組織形態(tài)學(xué)的變化，明確電針“足三里”穴對(duì)孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺發(fā)育不良影響的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用SPF級(jí)成年SD大鼠，周齡均為11周，雌鼠20只，均未經(jīng)產(chǎn)，雄鼠7只，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2006-009。操作過程在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物研究中心標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ級(jí)動(dòng)物房操作。室溫為（23±1）℃，相對(duì)濕度為（45±5）%，12/12 h晝夜節(jié)律。本項(xiàng)研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷和使用指導(dǎo)原則，及以減少、替代、優(yōu)化為核心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則，并且本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查，編號(hào)：3-2017020921-1021。

1.2 主要試劑和儀器

尼古丁（美國Sigma公司，批號(hào)：BCBR5093V）；多聚甲醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20140427）；二甲苯（北京化工廠，批號(hào)：20150911）；蔗糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170406）；無水乙醇（北京化工廠，批號(hào)：20160113）；華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）規(guī)格：0.20 mm×13.00 mm；二導(dǎo)HAN′s穴位刺激儀器（LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司）；AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)；BT223S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡TX51[奧林巴斯（中國）有限公司]。

1.3 分組

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即生理鹽水組（S組）、生理鹽水加電針“足三里”組（S+ST36組）、尼古丁組（N組）、尼古丁加電針“足三里”組（N+ST36組），每組各5只大鼠。

1.4 合籠并光學(xué)顯微鏡下觀察陰道涂片情況

雌鼠與雄鼠3∶1合籠交配，次日用光學(xué)顯微鏡觀察陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日記為受孕0 d，雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。

1.5 造模方法

按照Rehan等[13]制備疾病模型的方法，從受孕第6天起，開始皮下注射尼古丁，每只1 mg/（kg·d），100 μL，至妊娠結(jié)束前1 d；在生產(chǎn)當(dāng)天停止注射，之后繼續(xù)注射尼古丁給母鼠，至子代大鼠出生后第21天。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組處理方法

S組：注射生理鹽水，注射量、注射方式和時(shí)程同N組。

S+ST36組：注射生理鹽水配合電針“足三里”穴治療。生理鹽水注射方法同S組。取穴方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[14]描述。從受孕第6天起，一直到子代大鼠出生后第21天。用華佗牌0.20 mm×13.00 mm毫針分別針刺雙側(cè)“足三里”穴（直刺7mm，接電針負(fù)極）及雙側(cè)“足三里”穴下方2 mm處（毫針刺入皮下，接電針正極），電針頻率2/15 Hz，強(qiáng)度1 mA。電針治療20 min，每日1次。

N組：見“1.5造模方法”。

N+ST36組：尼古丁注射配合電針“足三里”穴治療。尼古丁注射方法同N組，電針治療方法同S+ST36組。

每組取8只子代大鼠進(jìn)行檢測。

1.7 肺功能檢測

子代大鼠出生21 d行肺功能檢測。定標(biāo)后稱重大鼠，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射（注射劑量為55 mg/kg）麻醉后3～5 min，固定，于頸部正中行氣管切開，用鑷子暴露出氣管，在第三、四氣管環(huán)中間做倒T型切口并插管，之后用手術(shù)線系緊插入氣管的插管。之后把大鼠放入體描箱，連接呼吸機(jī)。待呼吸穩(wěn)定后，進(jìn)行RC標(biāo)記，用AniRes 2005軟件導(dǎo)出大鼠的呼氣峰值（PEF）、氣道阻力（RL）、肺動(dòng)脈順應(yīng)性（Cdyn）進(jìn)行分析。

1.8 標(biāo)本采集及肺指數(shù)計(jì)算

腹主動(dòng)脈放血后，迅速開胸，分離肺臟，剔除氣管及血液稱肺濕重。根據(jù)動(dòng)物體重和肺濕重計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺重（mg）/體重（g）×100%。

1.9 肺灌注及組織形態(tài)學(xué)觀察

子代大鼠出生21 d后，以2%戊巴比妥鈉麻醉新生鼠，取血后開胸，取整個(gè)肺和心臟，用注射器從氣管注射4%多聚甲醛使肺充盈，并用繩子結(jié)扎，浸泡在多聚甲醛中，4～5 h后將肺、心臟用PBS沖洗兩次；浸泡在已經(jīng)過濾的30%的蔗糖溶液中，前3 d每天換1次蔗糖，第3天切除心臟；之后每2天換1次蔗糖，直到肺組織全部沉到瓶底。將肺組織取出，石蠟包埋后，5 μm厚切片，HE染色后，在200倍光鏡下觀察肺泡化程度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)方差齊后，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針“足三里”穴對(duì)PNE新生鼠肺功能的影響

2.1.1 對(duì)PEF的影響 與S組比較，S+ST36組無明顯變化（P > 0.05），而N組顯著降低（P < 0.05）；與N組比較，N+ST36組顯著升高（P < 0.05）。見圖1。

2.1.2 對(duì)RL的影響 與S組比較，S+ST36組無明顯變化（P > 0.05），而N組顯著升高（P < 0.05）；與N組比較，N+ST36組顯著降低（P < 0.05）。見圖2。

2.1.3 對(duì)Cydn的影響 與S組比較，S+ST36組無明顯變化（P > 0.05），而N組顯著降低（P < 0.05）；與N組比較，N+ST36組顯著升高（P < 0.05）。見圖3。

2.2 電針“足三里”穴對(duì)PNE新生鼠肺指數(shù)的影響

與S組比較，S+ST36組無明顯變化（P > 0.05），而N組顯著降低（P < 0.05）；與N組比較，N+ST36組顯著升高（P < 0.05）。見圖4。

2.3 電針“足三里”穴對(duì)孕期和哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下觀察，與S組比較，S+ST36組新生鼠肺組織中肺泡數(shù)稍增多，N組新生鼠肺組織中肺泡數(shù)明顯減少，肺泡體積增大，部分肺泡壁破裂相互融合；與N組比較，N+ST36組新生鼠肺組織中肺泡數(shù)量增多，肺泡面積減小，肺泡壁破裂融合有所改善。見圖5。

3 討論

尼古丁是煙草中脂溶性較高的生物堿，可被快速吸收并能透過胎盤在胎兒體內(nèi)蓄積，被認(rèn)為是煙草中危害胎兒健康的主要毒性成分[15]；同時(shí)，有證據(jù)證實(shí)尼古丁可在吸煙母親的母乳中聚集[16]。因此，婦女孕期和哺乳期抽煙可導(dǎo)致尼古丁通過胎盤或乳汁進(jìn)入胎兒及新生兒體內(nèi)，影響胎兒生長發(fā)育。PNE對(duì)后代多系統(tǒng)均可產(chǎn)生不良影響，如呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等[17-21]，尤其是對(duì)呼吸系統(tǒng)影響明顯，可導(dǎo)致肺發(fā)育不良，對(duì)此治療多用糖皮質(zhì)激素，但有效率有限且副作用較大。因此，探尋一種安全、有效的干預(yù)措施是一個(gè)亟待解決的難題。

本研究采用Rehan等[13]皮下注射尼古丁的方法造模，也是目前國際上比較公認(rèn)的模型制備方法。給予1 mg/kg的尼古丁注射大約相當(dāng)于成人（60 kg）每天吸食5支香煙的尼古丁攝入量[22]，既能很好地復(fù)制人類孕期及哺乳期吸煙導(dǎo)致新生兒肺發(fā)育不良的模型，又不會(huì)引起大鼠及胎兒的死亡。

足三里穴是強(qiáng)身保健的要穴，具有理脾胃、調(diào)氣血、補(bǔ)虛弱、宣暢氣機(jī)等諸多功效?！夺樉拇蟪伞分杏涊d足三里“諸病皆治”，《外臺(tái)秘要》記載：“三里養(yǎng)后天之氣，灸三里可使元?dú)獠凰ァ?，說明足三里穴具有全身強(qiáng)壯的作用。現(xiàn)代研究認(rèn)為，針灸足三里穴具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，且這種作用具有整體性和雙向性[12-14]。古今大量的實(shí)踐都證實(shí)，足三里不僅可以健脾和胃，用于脾胃、腸腑疾病的治療，還能夠調(diào)動(dòng)、激發(fā)或維持機(jī)體的自身功能而防病治病。此外，古籍和現(xiàn)代研究均認(rèn)為足三里穴對(duì)肺系疾病具有良好的調(diào)治作用[15-17]。因此，足三里是一個(gè)能防治多種疾病，強(qiáng)身健體的重要穴位。本研究不是治療母鼠的呼吸系統(tǒng)疾病，而是為了通過干預(yù)母鼠達(dá)到保護(hù)新生鼠肺發(fā)育的目的。因此，本研究選取電針母鼠“足三里”穴，觀測是否可以通過增強(qiáng)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)修復(fù)功能，對(duì)PNE新生鼠肺發(fā)育不良有保護(hù)作用。

大量研究表明，孕期尼古丁暴露可顯著降低后代PEF，增加RL，降低Cydn[2-3]。RL與呼吸功能關(guān)系密切，RL增大與多種呼吸系統(tǒng)疾病有直接關(guān)系；Cydn與肺組織彈性和RL有關(guān)，當(dāng)肺組織彈性降低或RL增加時(shí)，Cydn會(huì)降低；而PEF是反映氣道通暢性的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，PNE新生鼠PEF顯著降低、RL顯著增高、Cydn顯著降低，而電針“足三里”穴可顯著升高PNE新生鼠PEF和Cydn，并顯著降低RL，說明電針“足三里”穴可以通過降低RL、提高Cydn改善PNE新生鼠的肺功能。Ji等[23]研究結(jié)果表明，電針PNE大鼠“足三里”，可以顯著升高新生鼠PPAR-γ水平，降低β-catenin水平，因此電針“足三里”保護(hù)新生鼠肺功能的作用可能通過上調(diào)PPAR-γ或下調(diào)β-catenin通路來實(shí)現(xiàn)的。

肺泡是肺部氣體交換的主要部位，也是肺的功能單位，肺泡結(jié)構(gòu)異常則會(huì)影響肺換氣功能。Maritz等[4]在研究孕期尼古丁暴露對(duì)后代氣體交換的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，孕期尼古丁暴露可使二代鼠的肺泡數(shù)和隔膜中的毛細(xì)血管數(shù)目顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，PNE新生鼠肺組織中肺泡數(shù)明顯減少，肺泡體積增大，部分肺泡壁破裂相互融合，與Maritz等[4]結(jié)果一致。而電針母鼠“足三里”穴后，孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺組織中肺泡數(shù)量增加，肺泡面積減小，肺泡壁破裂融合有所改善，說明電針“足三里”穴可以通過改善PNE引起的新生鼠肺結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而改善氣體交換功能，從而保護(hù)子代大鼠肺發(fā)育損傷。Sekhon等[2]研究發(fā)現(xiàn)，孕期尼古丁暴露導(dǎo)致肺發(fā)育不良的二代猴肺的絕對(duì)重量和相對(duì)重量（每100克體重的肺重量）分別降低16%和14%。本研究發(fā)現(xiàn)孕期和哺乳期尼古丁暴露后新生鼠肺指數(shù)顯著降低，與Sekhon等[2]結(jié)果一致，而電針“足三里”穴可顯著升高孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠的肺指數(shù)，說明電針“足三里”穴可以促進(jìn)孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺部發(fā)育。

綜上所述，電針孕期和哺乳期大鼠“足三里”穴可以通過改善新生鼠肺功能、肺指數(shù)及肺組織形態(tài)學(xué)變化發(fā)揮對(duì)新生鼠肺發(fā)育的保護(hù)效應(yīng)，具體調(diào)解途徑和發(fā)生機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。

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