甘國興 劉毓 李勁平 張國民 易仲媛

[摘要] 目的 探討壯骨止痛方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）及骨組織β2-AR表達的影響。 方法 72只SPF級雌性SD大鼠隨機選出12只，摘除卵巢周圍相應(yīng)質(zhì)量脂肪后作為假手術(shù)組。其余60只采用雙側(cè)去卵巢法制備骨質(zhì)疏松病理模型，隨機分為模型組、壯骨止痛方高劑量組（13.2 g/kg）、中劑量組（6.6 g/kg）、低劑量組（3.3 g/kg）和戊酸雌二醇組（2.1×10-5 g/kg），每組各12只。模型組及假手術(shù)組給予等體積純凈水，均干預(yù)13周。采用ELISA法檢測血清CGRP含量，免疫組化法檢測骨組織β2-AR蛋白表達。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CGRP含量顯著減少，骨組織β2-AR蛋白表達顯著下調(diào)，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，戊酸雌二醇組及壯骨止痛方各劑量組大鼠血清CGRP含量顯著增加，骨組織β2-AR蛋白表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。壯骨止痛方不同劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 壯骨止痛方能夠促進去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP表達，上調(diào)骨組織β2-AR蛋白表達，這可能是其抗骨質(zhì)疏松的作用機制之一。

[關(guān)鍵詞] 骨質(zhì)疏松；壯骨止痛方；降鈣素基因相關(guān)肽；β2型腎上腺素能受體

[中圖分類號] R259 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the effect of Zhuanggu Zhitong prescription on the CGRP and β2-AR in ovariectomized osteoporosis rats and investigate its mechanism in anti-osteoporosis. Method 72 rats were randomly divided into sham operation group （12 cases） and model group （60 cases）， the model group rats were ovariectomized osteoporosis and the sham operation group rats were excised equal weight fat. After the modeling， the rats were randomly divided into model group， Zhuanggu Zhitong prescription high-dose group （13.2 g/kg）， middle-dose group （6.6 g/kg）， low-dose group （3.3 g/kg） and estradiol valerate group （2.1×10-5 g/kg）， with 12 rats in each group. The model group and sham operation group rats were given equal volume water. All intervened for 13 weeks. The content of CGRP in serum was detected by ELISA and protein expression of β2-AR in bone tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with sham operation group， the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of model group were significantly declined， with high statistically significant differences （all P < 0.01）. Compared with the model group， the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of different doses Zhuanggu Zhitong prescription group and estradiol valerate group were increased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. There were no significant differences in different doses of Zhuanggu Zhitong prescription groups （P > 0.05）. Conclusion Zhuanggu Zhitong prescription can promote the secretion of CGRP and protein expression of β2-AR， which may be one mechanism of ZhuangguZhitong prescription to anti-osteoporosis.

[Key words] Osteoporosis； Zhuanggu Zhitong prescription； CGRP； β2-AR

壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松癥具有很好的療效[1]。骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κβ受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa β，RANK）/核因子κβ受體活化因子配體（ligand of receptor activator of nuclear factor kappa β，RANKL）信號通路在骨代謝中具有重要作用，是影響破骨細(xì)胞生成和調(diào)節(jié)其功能最重要的途徑，通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡，可以影響信號通路下游因子進而影響破骨細(xì)胞的增值和凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛方能夠上調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清及骨組織OPG表達，下調(diào)RANKL表達，提高OPG/RANKL比值[3]，但壯骨止痛方如何調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)系統(tǒng)通過與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上的腎上腺素受體結(jié)合對骨量進行調(diào)節(jié)，腎上腺素能可以調(diào)節(jié)OPG和RANKL的表達[4]。降鈣素基因相關(guān)肽（calctionin gene-related peptide，CGRP）通過與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，參與骨的生長、修復(fù)和重建[5]。本文從調(diào)節(jié)CGRP和β2-AR的角度探討壯骨止痛方抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機制。

1 對象與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物 200 g左右3月齡SPF級SD雌性大鼠72只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號NO.43004700005517。標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動物實驗中心清潔動物房，室溫23～25℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 藥物及試劑 壯骨止痛方（包括補骨脂、女貞子、淫羊藿、骨碎補、枸杞子等7味中藥）藥材購自長沙九芝堂股份有限公司，由中南大學(xué)藥學(xué)院李勁平教授鑒定并制備。戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，生產(chǎn)批號：J20130009），CGRP ELISA檢測試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司），β2-AR免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（BioTek，USA），HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽儀器有限公司），LEICA DMLB2 型雙目顯微鏡（德國LEICA公司），MIAS型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司），Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司），DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），Motic B5型顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥 按照參考文獻[3]方法，按體重指數(shù)隨機選出12只大鼠，摘除卵巢周圍相應(yīng)質(zhì)量的脂肪作為假手術(shù)組，其余60只大鼠采用雙側(cè)去卵巢法制備骨質(zhì)疏松病理模型，按體重隨機分為模型組、壯骨止痛方高劑量組（13.2 g/kg）、中劑量組（6.6 g/kg）、低劑量組（3.3 g/kg）和戊酸雌二醇組（2.1×10-5 g/kg），每組各12只。分組后，除模型組及假手術(shù)組給予等體積純凈水外，其余各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，均干預(yù)13周，劑量按人鼠體表面積換算。

1.2.2 血清CGRP含量檢測 給藥干預(yù)結(jié)束后，大鼠用10%水合氯醛麻醉后采血，靜置2 h，3500 r/min離心15 min，取上清液采用ELISA法按試劑盒說明書檢測血清CGRP含量。

1.2.3 骨組織β2-AR蛋白表達檢測 參照文獻[3]采用免疫組化法（SABC法）檢測骨組織β2-AR蛋白表達。以棕黃色或棕褐色為陽性，采用北航MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差齊性，則用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠血清CGRP和骨組織β2-AR的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CGRP含量顯著下降，骨組織β2-AR蛋白表達顯著下調(diào)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，戊酸雌二醇組大鼠血清CGRP含量顯著增加，骨組織β2-AR蛋白表達顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。壯骨止痛方干預(yù)后，與模型組比較，各劑量組大鼠血清CGRP含量均顯著增加，骨組織β2-AR蛋白表達增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）；壯骨止痛方不同劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1，圖1（封三）。

3 討論

壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、枸杞子、川牛膝等7味藥物組成，既著重補腎氣、溫腎陽，兼顧滋補肝腎陰精，同時加用通經(jīng)化瘀活絡(luò)之品，具有補益肝腎、強筋骨的作用，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有確切療效[1]。壯骨止痛方能夠通過調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松模型大鼠OPG/RANKL平衡發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[4]，但是具體作用環(huán)節(jié)尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)[4]交感神經(jīng)系統(tǒng)可能是通過激活成骨細(xì)胞上的β2-AR進而激活破骨細(xì)胞分化因子RANKL來間接發(fā)揮對破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，CGRP能夠調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達量的相對比值發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。因此，研究壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP和β2-AR的影響，可以闡明其調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡的具體作用環(huán)節(jié)。

CGRP通過與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，參與調(diào)節(jié)骨的生長、修復(fù)及改建[5]。梁偉[6]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的降鈣素基因相關(guān)肽可以促進骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，且呈劑量依賴性。楊亞東等[7]研究表明，CGRP能夠調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達量的相對比值，間接地參與骨折愈合過程的調(diào)節(jié)。陳光華等[8]等研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能夠經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值，進而調(diào)控骨的吸收與形成。去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP含量明顯降低，骨組織CGRP及其受體蛋白表達下調(diào)，藥物干預(yù)后血清及骨組織CGRP顯著增加，骨密度增加[9-10]。本研究中去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP蛋白表達下調(diào)，結(jié)果與文獻報道一致。

越來越多的研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，在骨量的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[11-14]。交感神經(jīng)系統(tǒng)可能是通過激活成骨細(xì)胞上的β2-AR進而激活破骨細(xì)胞分化因子RANKL來間接發(fā)揮作用的[15]。動物實驗研究表明，激活實驗鼠β2-AR可導(dǎo)致其成骨細(xì)胞數(shù)量、骨形成率和骨量減少；而抑制β2-AR則可明顯提高大鼠成骨細(xì)胞數(shù)量、骨礦物沉積率和骨量[16]。體外研究表明，激活成骨細(xì)胞上的β2-AR可抑制c-MYC基因的表達，進而抑制成骨細(xì)胞的增殖和骨形成[17]。激活骨髓基質(zhì)干細(xì)胞上的β2-AR，可以激活PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨形成[18]。研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織β2-AR表達升高，骨碎補總黃酮可以降低模型大鼠骨組織β2-AR表達，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[19]。本研究中去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織β2-AR表達降低，結(jié)果與文獻報道相反[19]，其原因尚未清楚，需要進一步深入研究闡明。

前期研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清及骨組織RANKL表達顯著增加，OPG表達顯著下調(diào)，OPG/RANKL比值減少，壯骨止痛方能夠顯著降低模型大鼠血清及骨組織RANKL表達，上調(diào)OPG表達，提高OPG/RANKL比值[3，20]。本研究中，去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP含量顯著下降，骨組織β2-AR蛋白表達顯著下調(diào)；壯骨止痛方干預(yù)后，各劑量組大鼠血清CGRP含量顯著增加，骨組織β2-AR蛋白表達顯著上調(diào)；壯骨止痛方不同劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推測壯骨止痛方可能通過調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP及β2-AR表達，作用于OPG/RANKL/RANK信號通路，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，其具體作用環(huán)節(jié)還需進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] 曾英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對去卵巢雌鼠骨質(zhì)疏松癥骨密度及相關(guān)生化指標(biāo)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，28（2）：10-12.

[2] 李應(yīng)福，李寧，謝興文.OPG/RANK/RANKL信號軸與原發(fā)性骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（1）：115-119.

[3] 甘國興，李勁平，劉毓，等.壯骨止痛方調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017， 34（7）：938-942.

[4] 王楊雨凡，陳一心.交感神經(jīng)系統(tǒng)對骨量調(diào)控作用的研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2012，18（9）：854-860.

[5] 郭紀(jì)濤，譚雄進.降鈣素基因相關(guān)肽對骨質(zhì)疏松癥骨組織及胃腸作用的研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2015， 21（1）：121-124.

[6] 梁偉.降鈣素基因相關(guān)肽對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[7] 楊亞東，周娟，高輝，等.失神經(jīng)支配在大鼠骨折愈合過程中降鈣素基因相關(guān)肽對骨保護素/破骨細(xì)胞分化因子影響的實驗研究[J].中華手外科雜志，2012，28（4）：233-237.

[8] 陳光華，黃貴芝，林顥，等.降鈣素基因相關(guān)肽對維甲酸致老年骨質(zhì)疏松大鼠OPG/RANKL信號通路的影響及療效[J].中國老年學(xué)雜志，2015，35（19）：5446-5448.

[9] 朱曉峰，王廷春，張榮華，等.益骨膠囊對去卵巢大鼠骨密度及血漿和骨組織CGRP和SP含量的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（5）：1054-1056.

[10] 呂辰鵬，楊麗，孫影，等.去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織CGRP及其1型受體的表達[J].中國病理生理雜志，2011，27（5）：976-979.

[11] Zaidi M. Neural surveillance of skeletal homeostasis [J]. Cell Metab，2005，1（4）：219-221.

[12] Nagao M，F(xiàn)einstein TN，Ezura Y，et al. Sympathetic control of bone mass regulated by osteopontin [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（43）：17 767-17 772.

[13] He JY，Jiang LS，Dai LY. The roles of the sympathetic nervous system in osteoporotic diseases：A review of experimental and clinical studies [J]. Ageing Res Rev，2011， 10（2）：253-263.

[14] Kajimura D，Hinoi E，F(xiàn)erron M，et al. Genetic determination of the cellular basis of the sympathetic regulation of bone mass accrual [J]. J Exp Med，2011，208（4）：841-851.

[15] Elefteriou F，Ahn JD，Takeda S，et al. Leptin regulation of bone resorption by the sympathetic nervous system and CART [J]. Nature，2005，434（7032）：514-520.

[16] 周正，趙長銘，焦凱，等.交感神經(jīng)系統(tǒng)-腎上腺素能受體對骨改建的調(diào)節(jié)作用[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015， 42（3）：348-351.

[17] Komoto S，Kondo H，F(xiàn)ukuta O，et al. Comparison of β-adrenergic and glucocorticoid signaling on clock gene and osteoblast-related gene expressions in human osteoblast [J]. Chronobiol Int，2012，29（1）：66-74.

[18] Li H，F(xiàn)ong C，Chen Y，et al. Beta2- and beta3-，but notbeta1-adrenergic receptors are involved in osteogenesis of mouse mesenchymal stem cells via cAMP/PKA signaling [J]. Arch Biochem Biophys，2010，496（2）：77-83.

[19] 孫影，楊麗，呂辰鵬，等.骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清中瘦素、白細(xì)胞介素6、前列腺素E2及骨組織中β2-腎上腺素受體的影響[J].中國病理生理雜志，2011，27（4）：755-758.

[20] 楊軍，莫新民.壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松大鼠Wnt β-catenin、RANKL/RANK/OPG信號通路的影響[J].北京中醫(yī)藥，2017，36（7）：611-613.