梁汝慶， 姜 婧， 丁新生

腦缺血再灌注后，缺血的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的炎性因子，IL-6 是其中很重要的細(xì)胞因子[1～4]。大量研究均支持炎癥反應(yīng)參與了缺血性腦損傷，它是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的一種連鎖過(guò)程[5]。沈等[6]研究結(jié)果提示炎癥反應(yīng)遍及全腦并作用全身，貫穿腦缺血再灌注整個(gè)病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用松齡血脈康聯(lián)合脈血康對(duì)大鼠進(jìn)行4 w預(yù)處理，在相同時(shí)間點(diǎn)采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損狀況，檢測(cè)腦組織和血清IL-6濃度及缺血側(cè)腦組織水含量及梗死體積，旨在了解松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血-再灌注后IL-6表達(dá)變化以及腦水腫和腦梗死體積的影響，為松齡血脈康聯(lián)合脈血康在缺血性卒中預(yù)防中的神經(jīng)保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠75只，1月齡，體重(110±10)g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005]，在GB14925-2001標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)。大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為松齡血脈康預(yù)處理組(SL-xmk)，脈血康預(yù)處理組(M-xk)、松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理組(SL-M)、假手術(shù)組和生理鹽水對(duì)照組，每組n=15。SL-xmk組應(yīng)用松齡血脈康干粉(由成都康弘藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)090301)加生理鹽水配制成懸浮液灌胃(937.5 mg/kg)[ 7]；M-xk組采用脈血康膠囊(貴州信邦制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090723)加生理鹽水配制成懸浮液[1000.0 mg/(kg·d)][ 8 ]。SL-M組采用SL-xmk懸浮液[937.5 mg/(kg·d)]加M-xk懸浮液[1000.0 mg/(kg·d)]聯(lián)合應(yīng)用，以上三組預(yù)防性灌胃4 w。假手術(shù)組和生理鹽水對(duì)照組均給予等容量生理鹽水灌胃(1 ml/100 g)，預(yù)處理時(shí)程同藥物預(yù)防組。

1.2 MCAO模型制備 在預(yù)處理時(shí)程終點(diǎn)，參照Longa等[9，10]的方法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，逐層鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近心端距分叉處0.5 cm處剪一0.2 mm左右小口，將一段長(zhǎng)5 cm，頭端加熱成直徑約0.28 mm光滑球型的4-0號(hào)單絲尼龍魚(yú)線栓自頸總動(dòng)脈切口處插入，輕柔推進(jìn)，使其沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，線頭進(jìn)入約(18.0±0.5)mm后感到一定的阻力時(shí)即停止進(jìn)線。插線成功后，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈固定尼龍線栓，縫合頸部切口。假手術(shù)組不插入線栓，其他步驟相同。血流阻斷2 h后緩緩拔出線栓，再灌注24 h后處死動(dòng)物進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。術(shù)中和術(shù)后用白熾燈保持肛溫(37.0±0.5)℃范圍內(nèi)，直至動(dòng)物蘇醒。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 動(dòng)物蘇醒后采用Longa等[9]報(bào)道的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，分別于再灌注2 h、6 h、24 h時(shí)評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：缺血對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收、不能完全伸展；2分：行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向偏癱側(cè)傾的；4分：意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走?！?分說(shuō)明模型制作成功，評(píng)分0分和4分以及出現(xiàn)癲癇發(fā)作和取材時(shí)發(fā)現(xiàn)腦出血者均剔除，隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 大鼠血清抽取及腦組織勻漿制備 每組取5只大鼠，末次給藥24 h內(nèi)給予10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟(以5 ml注射器抽取心尖部血液3 ml，37 ℃水浴30 min后，3000 r/min離心10 min，留取血清備用)。開(kāi)顱取腦，以萬(wàn)分之一電子天平準(zhǔn)確稱取大鼠缺血區(qū)和健側(cè)相同部位腦組織100 mg加入1 ml 0.9%生理鹽水，在組織勻漿器中研磨，制備成10%組織勻漿，全部勻漿過(guò)程在4 ℃冰浴環(huán)境下完成。

1.5 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織及血清IL-6[6]取備用血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作，根據(jù)已知濃度的人IL-6(試劑盒提供)進(jìn)行梯度稀釋并測(cè)定450 nm吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)標(biāo)本均采用復(fù)孔，復(fù)孔測(cè)定的吸光度值取均數(shù)減去零標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值的均數(shù)作為該濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度或檢測(cè)標(biāo)本的測(cè)定值，進(jìn)一步通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算出濃度濃度。

1.6 腦水含量和梗死體積百分比的測(cè)定[10]腦水含量采用干濕重法檢測(cè)：每組取5只大鼠，斷頭取腦，左右腦分開(kāi)，取右腦，除去小腦和低位腦干和嗅球，立即用雙量程電子分析天平稱濕重，然后在電熱恒溫干燥箱中106 ℃干燥48 h后稱量干重。腦水含量計(jì)算公式為：水含量=(濕重-干重) /濕重×100%。

腦梗死體積采用氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC)染色法檢測(cè)：每組取5只大鼠，斷頭取腦，置-4 ℃冰箱30 min，從額極致枕極沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片避光置于30 ml 2% TTC溶液(Sigma公司)中20 min，然后用10%甲醛溶液固定腦片。正常組織呈紅色，梗死腦組織呈蒼白色。分離蒼白區(qū)和非蒼白區(qū)計(jì)算梗死百分比。計(jì)算公式為：梗死百分比(%) =蒼白區(qū)重/(蒼白區(qū)重 +非蒼白區(qū)重) ×100%。

2 結(jié) 果

2.1 藥物預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能正常。藥物預(yù)處理組2 h、6 h、24 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分較生理鹽水對(duì)照組均降低(P<0.05)。SL-M預(yù)處理組2 h、6 h、24 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分較SL-xmk、M-xk組均降低(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 大鼠腦組織和血清IL-6含量 對(duì)照組缺血側(cè)腦組織勻漿IL-6濃度明顯增高，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物預(yù)處理各組缺血側(cè)腦組織勻漿IL-6濃度較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SL-M組較對(duì)照組降低較顯著，且優(yōu)于SL-xmk和M-xk組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健側(cè)腦組織兩者的變化趨勢(shì)與缺血側(cè)大致相同。假手術(shù)組血清IL-6濃度較低[23.08±4.24pg/ml]，對(duì)照組大鼠血清IL-6濃度升高，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但升高幅度不如腦組織明顯。藥物預(yù)處理各組大鼠血清IL-6濃度與生理鹽水對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，SL-M組降低更顯著，優(yōu)于SL-xmk和M-xk組(見(jiàn)表2)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

注：與對(duì)照組比較★P<0.05；與SL-xmk、M-xk比較▲P<0.05

表2 各組大鼠腦組織和血清IL-6含量變化

注：與假手術(shù)組比較★P<0.05；對(duì)照組比較▲P<0.05；與SL-xmk組、M-xk組比較▲▲P<0.05

2.3 腦水含量和梗死率測(cè)定 假手術(shù)組大鼠腦組織正常，腦水含量為(56.46±5.74)%。藥物預(yù)處理組腦水含量較生理鹽水對(duì)照組顯著降低(P<

0.05)，梗死體積顯著縮小(P<0.05)，SL-M組較對(duì)照組降低較顯著，且優(yōu)于SL-xmk和M-xk組，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

組別例數(shù)腦水含量梗死體積假手術(shù)組對(duì)照組SL-xmk組M-xk組SL-M組5555556.46±5.7487.81±8.65★76.01±7.16▲74.62±7.65▲63.64±6.11▲▲035.61±5.31★28.45±4.47▲27.23±4.58▲20.88±4.28▲▲

注：與假手術(shù)組比較★P<0.05；對(duì)照組比較▲P<0.05；與SL-xmk組、M-xk比較▲▲P<0.05

3 討 論

腦梗死后缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)在白細(xì)胞聚集、氧自由基產(chǎn)生、溶酶體破壞、水解酶生成以及炎癥介質(zhì)形成等方面。腦缺血-再灌注(I-R)時(shí)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損害，隨著腦I-R炎癥機(jī)制研究的深入，炎性細(xì)胞和炎性因子在其中的作用越來(lái)越受到重視。腦缺血-再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫，此病理生理過(guò)程的基礎(chǔ)是以IL-6等細(xì)胞因子為代表的多種炎性介質(zhì)失控、釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”機(jī)制[11]。Vila等[12]應(yīng)用雙夾心 ELISA 法對(duì)231例急性腦梗死患者的血清白細(xì)胞介素6含量進(jìn)行檢測(cè)，并采用Logistic多元回歸分析后發(fā)現(xiàn)，腦脊液和血清中白細(xì)胞介素6是腦梗死的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，與體溫、血糖、纖維蛋白原和腦梗死體積密切相關(guān)，腦梗死體積越大，血清白細(xì)胞介素6水平越高，而與腦梗死發(fā)生部位無(wú)關(guān)[13]。

松齡血脈康采用松針、珍珠層粉、葛根等成分，經(jīng)現(xiàn)代制劑技術(shù)加工、精制而成的復(fù)方中藥制劑；主要有效成分為原花青素、葛根素、總黃酮等，羅氏等[14]通過(guò)基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，松齡血脈康作用于自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)后可促進(jìn)或抑制許多基因的轉(zhuǎn)錄改變，而這些基因在調(diào)控脂代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞發(fā)育和分化等方面起了重要作用。郭等[15]從氧化應(yīng)激損傷方面證實(shí)松齡血脈康對(duì)腦缺血-再灌注損傷有明顯保護(hù)作用。我們已有研究結(jié)果表明松齡血脈康可通過(guò)抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)作用[7，16，17]。國(guó)外研究提示松樹(shù)制劑能刺激e-NOS活性，增加NO濃度，提高血漿前列環(huán)素，降低內(nèi)皮縮血管肽1和血栓烷，擴(kuò)張血管和抗炎的作用[18，19]。

脈血康膠囊是采用醫(yī)用水蛭活體經(jīng)低溫冷凍加工而成的膠囊劑，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)水蛭的主要有效成分為水蛭素，由水蛭唾液腺分泌的含65 個(gè)氨基酸的酸性多肽，是高度特異的凝血酶抑制劑，與凝血酶結(jié)合后，能抑制凝血酶與血栓調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合作用，阻止纖維蛋白原和纖維蛋白和血細(xì)胞結(jié)合形成血凝塊[20]；水蛭素可降低血液黏稠度，降低血漿中纖維蛋白原的含量[21]；還可降低血小板表面活性，抑制血小板黏附和聚集[22]；其抗凝作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ，對(duì)已生成的凝血酶也可起作用，故其抗凝活性可能優(yōu)于肝素[23]。水蛭素是迄今為止世界上發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的天然凝血酶特異性抑制劑[24]，由于它安全且沒(méi)有副作用，因而比肝素更有優(yōu)越性[25]。

本實(shí)驗(yàn)采用松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)防性給藥，在相同時(shí)間點(diǎn)采用線栓法建立缺血-再灌注大鼠模型，模擬人類(lèi)缺血性卒中再灌注狀態(tài)，于再灌注2 h、6 h、24 h后觀察大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，檢測(cè)腦組織和血清IL-6濃度，同時(shí)檢測(cè)缺血側(cè)腦組織含水量、梗死體積，了解松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血-再灌注后炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化、作用部位，以探討其炎癥反應(yīng)作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理后MCAO大鼠，與對(duì)照組與單藥預(yù)處理組比較，聯(lián)合用藥預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，全腦及血清中IL-6濃度均降低，與對(duì)照組、松齡血脈康、脈血康組比較差異有顯著性意義。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們觀察到松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理組在MCAO后，缺血側(cè)腦組織含水量、腦梗死體積率均較對(duì)照組、松齡血脈康、脈血康組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組腦組織和血清中IL-6表達(dá)均高于假手術(shù)組，提示IL-6是一種致炎細(xì)胞因子，缺血早期對(duì)腦水腫及腦梗死體積有一定影響，與已有研究相一致[6，26]，我們也發(fā)現(xiàn)缺血再灌注大鼠的健側(cè)腦組織同時(shí)伴隨著高水平的IL-6 表達(dá)。這可能是由于：(1)缺血再灌注過(guò)程一方面刺激全身性循環(huán)系統(tǒng)單核-巨噬細(xì)胞系分泌IL-6增加；另一方面缺血再灌注側(cè)局灶性的炎癥反應(yīng)可以通過(guò)神經(jīng)元軸突傳遞和釋放，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)，激活全腦的炎癥反應(yīng)；(2)缺血側(cè)腦組織水腫導(dǎo)致腦中線移位，健側(cè)腦組織受壓、缺血，從而引起炎性因子分泌增加。我們分析可能的機(jī)制為：(1)IL-6上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的粘附因子(ICAM-1) 的表達(dá)，引起血管炎性反應(yīng)，加重腦缺血；(2)使血腦屏障的通透性增加，腦組織水腫；(3)通過(guò)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，加劇腦組織的炎癥反應(yīng)，釋放大量的毒性物質(zhì)，加重神經(jīng)細(xì)胞的壞死[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理后抑制了大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠腦組織中IL-6的高表達(dá)，減輕了腦水腫和腦梗死體積，改善了神經(jīng)功能，降低了全腦及外周血清IL-6的濃度，發(fā)揮了一定的抗炎癥反應(yīng)作用。

綜上所述，松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理大鼠MCAO后，血清和腦組織IL-6表達(dá)均降低，缺血腦組織水濃度、梗死體積及神經(jīng)功能均有改善，提示松齡血脈康聯(lián)合脈血康預(yù)處理不僅可抑制大鼠腦缺血再灌注后腦組織IL-6的表達(dá)，而且可抑制局部腦組織損傷引起的全身毒血反應(yīng)，減輕腦水腫和腦梗死體積，改善神經(jīng)損傷，為松齡血脈康聯(lián)合脈血康防治缺血性卒中提供了治療的理論依據(jù)。

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