李富強(qiáng)， 王 偉， 尹金鵬， 馮 濤， 尹曉剛， 鄧 倩， 劉榮志， 白宏英

線粒體功能障礙在缺血性腦損傷中起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙與線粒體ATP酶密切相關(guān)。線粒體ATP酶是一種存在于線粒體膜依靠ATP能量蛋白酶，主要有Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶組成；依靠ATP能量逆梯度轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體內(nèi)Na+、Ca2+，維持線粒體鈣平衡。腦缺血再灌注損傷后，線粒體功能衰竭，ATP合成障礙，線粒體ATP酶活性下降，引起線粒體內(nèi)鈣超載，最終引起細(xì)胞凋亡[1]。丹參屬于唇齒科植物，其根莖有活血、養(yǎng)血、通心絡(luò)作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用心血管疾病、腦血管疾病、白血病等[2]。注射用丹參多酚酸(Salvianolate)是從中藥丹參中提取的水溶成分，其主要成分是丹酚酸B，研究證明其可以通過提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，白細(xì)胞介素-10表達(dá)，減低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分起到腦保護(hù)作用[3]。但其對(duì)線粒體的保護(hù)作用研究較少，本研究通過大鼠缺血再灌注模型探討注射用丹參多酚酸的腦保護(hù)作用是否與線粒體ATP酶相關(guān)，為明確保護(hù)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備 健康雄性SD大鼠，體重(300±20)g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=18)：假手術(shù)組、注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組。模型制備：采用改良Zea Longa法制備大鼠右側(cè)中動(dòng)脈缺血再灌注模型。假手術(shù)組手術(shù)過程中，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈但不插入線栓。注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組線栓待缺血2 h后，緩慢抽出線栓再灌注24 h。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)右側(cè)Horner征、眼裂變小、瞳孔縮小和左側(cè)軀體運(yùn)動(dòng)障礙評(píng)定為模型成功。丹參多酚酸組于缺血2 h再灌注24 h后連續(xù)7 d給予10 mg/kg尾靜脈注射，每天1次。假手術(shù)組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。末次給藥6 h后功能評(píng)分后取腦。

1.1.2 主要試劑與儀器 注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011)，顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)；氯化三苯基四氮唑(TTC，批號(hào)：030227，北京化學(xué)試劑公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)，Kendro Labrotary)；石蠟切片機(jī)、倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；丙二醛試劑盒及ATP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦梗死體積測(cè)定 大鼠腦組織應(yīng)用冰箱-20 ℃冷凍20 min后取出，沿視交叉向前冠狀位平行依次切片2 mm×5片。將切好的腦片放置在2%TTC磷酸緩沖液中，恒溫箱37℃避光孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定。用數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。梗死體積百分比=(左側(cè)正常腦組織體積-右側(cè)正常腦組織的體積)/左側(cè)正常腦組織體積×100%，以此作統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材及HE染色標(biāo)本的制備 4%多聚甲醛(4℃)將大鼠灌流固定斷頭取腦后，將腦組織浸入4%多聚甲醛(4 ℃預(yù)冷)中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋。將包埋好的腦組織在恒溫切片機(jī)上沿冠狀面連續(xù)切片，片厚約5 μm，展片、撈片后置于載玻片上放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 ℃烤箱中烘烤30 min常規(guī)脫蠟，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至純水，Harris蘇木素染色15 min，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化3～5 s，自來水沖洗返藍(lán)；伊紅染色1 min，自來水沖洗。脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.3 腦組織線粒體的提取 利用差速離心法提取線粒體。麻醉后迅速處死動(dòng)物取腦，去除腦膜、小腦，嗅球、腦干后，留取右側(cè)大腦半球，冰鹽水沖去血液，用小剪刀于冰浴的小燒杯中將腦組織剪成邊長(zhǎng)約3 mm的小塊，應(yīng)用緩沖液(0.1 mol/ L Tris-HCl，pH 7.4，0.25 mol/L Sucrose，0.01 mol/ L EGTA)按9∶1比例混合后，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的玻璃勻漿器中，上下均勻勻漿10次制成10%勻漿(避免出現(xiàn)氣泡)。低溫高速離心機(jī)(溫度4 ℃)以7650 rpm轉(zhuǎn)速離心20 min后，取上清液再以8400 rpm轉(zhuǎn)速離心20 min后，取沉淀物加入線粒體保存液充分震蕩，反復(fù)吹打，得到線粒體懸浮液。上述操作均4 ℃下進(jìn)行[4]。Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。

1.2.4 線粒體丙二醛及ATP酶測(cè)定 丙二醛監(jiān)測(cè)采用硫代巴比妥酸(TBA)方法。丙二醛(結(jié)構(gòu)OHC-CH2-CHO)與硫代巴比妥酸反應(yīng)后產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。ATP酶即三磷酸腺苷酶，ATP酶分解ATP為ADP和無機(jī)磷，無機(jī)磷在660nm處有最大吸收峰。取腦線粒體懸浮液監(jiān)測(cè)，具體檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死體積 假手術(shù)組雙側(cè)腦組織均勻紅染，未發(fā)現(xiàn)梗死灶；IR組和丹參多酚酸組可見右側(cè)大腦半球不同范圍的蒼白色梗死灶。丹參多酚酸組腦梗死體積顯著小于IR組(P<0.05)(見圖1)。

注：與缺血再灌組相比*P<0.05

2.2 光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組(見圖2)神經(jīng)元胞質(zhì)呈深紅色，胞核呈藍(lán)色。細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清楚，核大而圓，核膜、核仁清晰可見。缺血再灌注組(見圖3)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，呈缺血性改變的錐體細(xì)胞，胞體腫脹變形成多角形、核固縮；丹參多酚酸組(見圖4)干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變程度均較缺血再灌注組輕，間質(zhì)水腫明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰，可見少量神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常、核固縮或消失。

圖2 假手術(shù)組

圖3 缺血再灌注組

各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化(HE染色 ×200)

2.3 丙二醛測(cè)定 丹參多酚酸治療組顯著抑制缺血再灌注后線粒體膜損傷。與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸治療組丙二醛含量(0.901±0.472)顯著減少(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組丙二醛含量(1.501±0.149)顯著增多(P<0.05)。(見圖5)

2.4 線粒體ATP酶的影響 缺血再灌注組Na+/K+ATP酶(2.968±0.178)，Ca2+ATP酶(3.641±0.145)，Mg2+ATP酶(1.055±0.153)與假手術(shù)組相比明顯下降(P<0.05)；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組Na+/K+ATP酶(5.032±0.154)，Ca2+ATP酶(4.987±0.122)，Mg2+ATP酶(2.503±0.260)能提高線粒體ATP酶活性(P<0.05)(見圖6)。

注：與缺血再灌組相比*P<0.05)；缺血再灌注組與假手術(shù)組相比P<0.05

圖5 丹參多酚酸組對(duì)線粒體丙二醛的影響

注：Na+/K+ATP酶：*與缺血再灌組相比(P<0.05)；Ca2+ATP酶：#與缺血再灌組相比(P<0.05)；Mg2+ATP酶：**與缺血再灌組相比(P<0.05)

圖6 丹參多酚酸對(duì)線粒體ATP酶的影響

3 討 論

我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后大鼠腦線粒體丙二醛含量升高，線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低，提示線粒體膜破壞，線粒體ATP酶功能障礙；HE切片上可以看到神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，核固縮，神經(jīng)元細(xì)胞減少，TTC染色可見腦梗死體積明顯增加。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血時(shí)線粒體功能障礙是神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素。正常情況下，線粒體依賴線粒體膜上ATP酶維持線粒體內(nèi)Na+、K+、Ca2+及線粒體內(nèi)膜電位平衡。腦缺血時(shí)，細(xì)胞無氧酵解，缺血區(qū)乳酸堆積，缺血區(qū)PH值降低，抑制三羧酸循環(huán)，而且組織內(nèi)H離子增加激活Na+/ H+交換。Na+內(nèi)流，線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)離子平衡破壞，ATP合成受抑制，尤其是再灌注時(shí)大量活性氧產(chǎn)生，損害線粒體細(xì)胞膜，線粒體結(jié)構(gòu)性破壞，導(dǎo)致ATP合成進(jìn)一步減少[5]。線粒體能量障礙引起線粒體膜上依靠ATP能量的Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低；Na+/K+ATP酶不能維持線粒體內(nèi)K+梯度優(yōu)勢(shì)，引起Na+內(nèi)流，Na+過度引起Na+/ Ca2+交換，Ca2+進(jìn)入線粒體，引起鈣超載[6]。Ca2+ATP酶和Mg2+ATP酶依靠ATP能量將Ca2+泵出，線粒體鈣平衡；線粒體損傷時(shí)線粒體膜破壞，ATP合成減少，線粒體內(nèi)Ca2+溶度增加，引起線粒體鈣超載，觸發(fā)線粒體通透型轉(zhuǎn)化孔開放[6]。線粒體通透型轉(zhuǎn)化孔開放引起分子量大于1500Da的物質(zhì)自由通過線粒體內(nèi)膜，引起線粒體腫脹，線粒體外膜破裂，釋放細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、核酸內(nèi)切酶G等促凋亡物質(zhì)釋放[7]；而且鈣超載激活依賴鈣離子降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞災(zāi)難性損傷[8]。

注射用丹參多酚酸是采用柱層析技術(shù)提取的丹參水溶成分，其主要有效成分是丹酚酸B。實(shí)驗(yàn)研究表明，丹參多酚酸通過上調(diào)高爾基磷酸化蛋白-3表達(dá)，激活A(yù)kt和mTOR磷酸化途徑減少TUNEL細(xì)胞起到腦保護(hù)作用[9]。我們研究發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸組丙二醛含量減少，Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高，與缺血再灌組相比，腦梗死體積明顯較少，HE接片神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰。因此我們認(rèn)為，提高線粒體ATP酶活性，維持線粒體離子平衡，保護(hù)線粒體膜穩(wěn)態(tài)可能是注射用丹參多酚酸發(fā)揮腦保護(hù)作用的主要機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen SD，Yang DI，Lin TK，et al. Roles of oxidative stress，apoptosis，PGC-1α and mitochondrial biogenesis in cerebral ischemia[J]. Int J Mol Sci，2011，12(10)：7199-7215.

[2]梁 勇，羊裔明. 丹參酮藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2000，31(4)：304-306.

[3]白 蓉，王 淑. 注射用丹參多酚酸對(duì)腦缺血大鼠 VEGF，IL-10 的影響[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2016，33(5)：411-416.

[4]李富強(qiáng)，白宏英，婁季宇，等. 腦缺血后處理對(duì)缺血再灌注腦組織線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28(9)：796-799.

[5]Walters AM，Porter GA，Brookes PS. Mitochondria as a drug target in ischemic heart disease and cardiomyopathy[J]. Circ Res，2012，111(9)：1222-1236.

[6]Suvanish Kumar VS，Gopalakrishnan A，Naziroglu M，et al. Calcium Ion-The Key Player in Cerebral Ischemia[J]. Curr Med Chem，2014，21(18)：2065-2075.

[7]Baines CP. The molecular composition of the mitochondrial permeability transition pore[J]. J Mol Cell Cardiol，2009，46(6)：850-857.

[8]Tajeddine N. How do reactive oxygen species and calcium trigger mitochondrial membrane permeabilisation[J]. Bba-Gen Subjects，2016，1860(6)：1079-1088.

[9]You H，Li T，Zhang J，et al. Reduction in ischemic cerebral infarction is mediated through golgi phosphoprotein 3 and Akt/mTOR signaling following salvianolate administration[J]. Curr Neurovasc Res，2014，11(2)：107-113.