王 璐 任長和 趙姣妹 許 飏 歐冊(cè)華△

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1疼痛科；2皮膚科，瀘州646000）

帶狀皰疹(herpes zoster,HZ)多發(fā)生于老年人及免疫低下者，其產(chǎn)生的疼痛給病人帶來巨大痛苦。然而，目前為止，帶狀皰疹治療不夠理想，歸根結(jié)底是對(duì)其病理機(jī)制不夠清楚。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示，T淋巴細(xì)胞與HZ疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，帶狀皰疹病毒感染T淋巴細(xì)胞時(shí)，T淋巴細(xì)胞凋亡增高[1]，HZ病人體內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫功能下降[2,3]。此外，CD95是外源性細(xì)胞凋亡途徑的重要受體，介導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的凋亡，CD95在一些病毒感染病人的淋巴細(xì)胞中表達(dá)增加，如梅毒、HIV等[4,5]。然而，CD95是否參與了HZ的發(fā)生，以及HZ病人T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率與其表面CD95表達(dá)水平的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究探討了HZ病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的凋亡情況，以及其細(xì)胞表面CD95抗原的表達(dá)情況，從而為更好了解及治療HZ提供理論依據(jù)。

方 法

1.一般資料

收集本院疼痛科及皮膚科2017年6月10日至2017年9月30日住院的急性期HZ病人33例，包括男16例，女17例；年齡13 ～ 81歲，平均(58.67 ± 15.74)歲。按年齡分兩組：中青年組（＜ 60 歲）16例，老年組（≥60歲）17例；按疼痛程度分3組：輕度疼痛組（2～4分）8例，中度疼痛組（5～7分）14例，重度疼痛組（＞ 7分）11例。同期收集健康對(duì)照者20例，其中男10例，女10例；年齡27～78歲，平均(59.00 ± 18.51)歲。兩組性別和年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞ 0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有臨床癥狀和體征符合診斷標(biāo)準(zhǔn)（參照趙辨《臨床皮膚病學(xué)》），且發(fā)病后未進(jìn)行相應(yīng)治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前接受相應(yīng)治療者；合并嚴(yán)重心肺等系統(tǒng)性疾?。幌到y(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾??；惡性腫瘤者；應(yīng)用免疫制劑者；其他部位感染者。

2.實(shí)驗(yàn)器材及試劑

流式細(xì)胞儀、紅細(xì)胞裂解液(555899)、FITC Annexin V 凋亡試劑盒( 556547)、CD8- PECyTM(557746)、CD95- PE(555674)、CD4- Per-CP-CyTM5.5抗體(552838)，試劑均購置于美國BD公司。

3.病人基本信息

病人入院后，由疼痛科及皮膚科相關(guān)護(hù)理人員記錄病人年齡、性別、疼痛程度。采用視覺模擬評(píng)分法(visual analogue scale,VAS) 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～1分，無痛；2～4分，輕度疼痛，病人能忍受；5～7分，中度疼痛，病人疼痛并影響睡眠；8～10分，重度疼痛，病人疼痛劇烈難忍。

4.外周血檢測(cè)指標(biāo)

標(biāo)本采集：病人入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血3 ml，用肝素抗凝，2 h內(nèi)處理標(biāo)本并進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞凋亡率及其細(xì)胞表面CD95的表達(dá)。

T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率檢測(cè)：取100 μl抗凝全血，加入 CD4抗體 20 μl、CD8抗體 5 μl，混勻，室溫避光孵育15 min。加入1×紅細(xì)胞裂解液2 ml，混勻，室溫避光裂解15 min，離心(1 000 r/min,5 min)，棄上清。加入1× binding buffer 2 ml，離心(1 000 r/min,5 min)，棄上清。加入Annexin-V FITC、PI試劑各5 μl，避光孵育15 min。加入 500 μl PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

T淋巴細(xì)胞表面CD95抗原表達(dá)水平檢測(cè)：取100 μl抗凝全血，加入 CD95抗體 20 μl、CD4抗體20 μl、CD8 抗體 5 μl，混勻，室溫避光孵育 15 min。加入1 × 紅細(xì)胞裂解液2 ml，混勻，室溫避光裂解15 min，離心(1 000 r/min,5 min)，棄上清。加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分析。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，不同疼痛程度組之間的比較采用方差分析，其他的組間比較采用t檢驗(yàn)，T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD95表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HZ組和對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率

結(jié)果顯示正常對(duì)照組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞僅有少許凋亡。HZ病人CD4+T細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組(P＜ 0.05)，CD8+T細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組（P＜ 0.05，見圖1）。

2.T淋巴細(xì)胞亞群表面CD95抗原的表達(dá)水平

HZ病人CD4+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P＜ 0.05)，CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)高于正常對(duì)照組（P＜ 0.05，見圖2）。

3.T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率與CD95表達(dá)的相關(guān)性分析

HZ病人CD4+T細(xì)胞凋亡率與其表面CD95表 達(dá) 呈 正 相 關(guān) (r= 0.75,P＜ 0.05)。HZ 病 人CD8+T細(xì)胞凋亡率與其表面CD95表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.53,P＜ 0.05，見圖 3）。

4.HZ病人不同年齡組T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率及CD95的表達(dá)水平

≥60歲組病人外周血CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞凋亡率都顯著高于＜ 60歲組病人(P＜ 0.05)，≥60歲組病人CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)水平均高于＜ 60歲組病人（P＜ 0.05，見圖4）。

5.HZ病人不同疼痛程度組T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率及CD95的表達(dá)水平

不同疼痛程度組的T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率及CD95的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，見圖5）。

6.HZ病人不同性別組T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率及CD95的表達(dá)水平

HZ病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的凋亡率及CD95的表達(dá)水平在男性和女性兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，見圖6）。

圖1 正常對(duì)照組與HZ病人外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞凋亡情況(%)(A-C)：CD4+T細(xì)胞凋亡情況；(D-F)：CD8+T細(xì)胞凋亡情況*P ＜ 0.05，與正常對(duì)照組比較Fig.1 The apoptosis level of CD4+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte in peripheral blood from control and HZ patients (%)(A-C): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (D-F): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte.*P ＜ 0.05,compared with normal Control group.

圖2 正常對(duì)照組與HZ病人外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況(%)(A-C)：CD4+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況；(D-F)：CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況*P ＜ 0.05，與正常對(duì)照組比較Fig.2 The expression of CD95 antigen on the surface of CD4+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte in peripheral blood from control group and HZ group (%)(A-C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D-F): the expression of CD95 on the CD8+ T lymphocyte surface*P ＜ 0.05,compared with normal Control group.

圖3 HZ病人T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD95表達(dá)的相關(guān)性(A)： CD4+ T細(xì)胞凋亡率與其表面CD95表達(dá)相關(guān)性；(B)：CD8+ T細(xì)胞凋亡率與其表面CD95表達(dá)相關(guān)性Fig.3 Correlation between the apoptosis rate of T lymphocyte and the expression of CD95 in HZ patients(A): correlation between the apoptosis rate of CD4+T lymphocyte and the expression of CD95; (B): correlation between the apoptosis rate of CD8+ T lymphocyte and the expression of CD95.

圖4 HZ病人不同年齡組T淋巴細(xì)胞凋亡率及CD95的表達(dá)水平(A)：CD4+T細(xì)胞凋亡情況；(B)：CD8+T細(xì)胞凋亡情況；(C)：CD4+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況；(D)：CD8+ T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況*P ＜ 0.05，與＜ 60歲組病人比較Fig.4 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different age in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface*P ＜ 0.05,compared with middle-aged group (＜ 60 years).

討 論

帶狀皰疹病毒是一種α皰疹病毒，它在體內(nèi)的再次激活導(dǎo)致HZ的發(fā)生[6]。相關(guān)研究證實(shí)HZ的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)，對(duì)帶狀皰疹病毒感染的控制是通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫而不是B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫[7,8]。動(dòng)物模型表明B細(xì)胞的缺失并不能改變疾病的嚴(yán)重程度，而在帶狀皰疹病毒接種過程中，CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的耗竭會(huì)導(dǎo)致病毒載量增高[9]。由此可見，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在帶狀皰疹病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞凋亡與病毒感染、免疫性疾病等密切相關(guān)，包括內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，是細(xì)胞數(shù)量減少的一個(gè)非常重要的起始程序，它可通過調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量，從而影響機(jī)體的免疫強(qiáng)度。本研究結(jié)果顯示，HZ病人外周血CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞凋亡率明顯高于健康對(duì)照組(P＜ 0.05)，提示T淋巴細(xì)胞的凋亡與HZ的發(fā)生密切相關(guān)，這與Konig等[1]在感染VZV后T淋巴細(xì)胞凋亡率增高的研究結(jié)果一致。早期的國內(nèi)外研究中只報(bào)道了HZ病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量發(fā)生變化，而CD95在HZ病程中的作用卻未見報(bào)道，我們此次的研究重點(diǎn)分析CD95是否通過外源性凋亡途徑調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的凋亡而參與HZ病程。

CD95是I 型跨膜蛋白，是細(xì)胞膜表面蛋白TNF/NGF-R家族的成員，表達(dá)于胸腺細(xì)胞、激活的淋巴細(xì)胞，與配體CD95L結(jié)合后可誘導(dǎo)凋亡，又稱為“死亡蛋白”，具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞毒性的重要功能[10,11]。在本次研究中，我們對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面的CD95抗原水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明HZ病人外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面的CD95抗原表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜ 0.05)，且CD4+T細(xì)胞表面的CD95表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r= 0.76,P＜ 0.05)，CD8+T細(xì)胞表面的CD95表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r= 0.53,P＜ 0.05)，提示CD95死亡信號(hào)通路是介導(dǎo)HZ病人CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞凋亡的重要途徑，與HZ的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖5 HZ病人不同疼痛程度組T淋巴細(xì)胞凋亡率及CD95的表達(dá)水平(A)：CD4+T細(xì)胞凋亡情況；(B)：CD8+T細(xì)胞凋亡情況；(C)：CD4+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況；(D)：CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況Fig.5 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different degree of pain in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface.

圖6 HZ病人不同性別組T淋巴細(xì)胞凋亡率及CD95的表達(dá)水平(A)：CD4+T細(xì)胞凋亡情況；(B)：CD8+T細(xì)胞凋亡情況；(C)：CD4+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況；(D)：CD8+T細(xì)胞表面CD95的表達(dá)情況Fig.6 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different gender in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface.

最后，相關(guān)研究顯示年齡和疼痛是發(fā)生帶狀皰疹后神經(jīng)痛（postherpetic neuralgia,PHN）的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[12～14]。而對(duì)于HZ病人而言，這些風(fēng)險(xiǎn)因素與機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的凋亡情況，以及與T淋巴細(xì)胞表面CD95抗原水平的關(guān)系是不清楚的。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)老年病人（≥60歲）外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的凋亡率及其表面CD95抗原的表達(dá)水平與中青年病人（＜ 60歲）相比顯著增高(P＜ 0.05)，不同性別組、不同疼痛程度組的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞凋亡率及CD95表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)，提示T淋巴細(xì)胞凋亡水平及CD95表達(dá)水平與病人性別及疼痛程度無明顯相關(guān)性，而與年齡密切相關(guān)。即年齡越大，HZ病人T淋巴細(xì)胞的凋亡水平及其表面的CD95抗原表達(dá)水平則越高，使機(jī)體免疫力越低，而年齡又是發(fā)生PHN的危險(xiǎn)因素，所以CD95介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡增加可能是老年病人更易發(fā)生PHN的機(jī)制之一。

綜上所述，本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)HZ病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞凋亡率增加，其細(xì)胞表面CD95抗原的表達(dá)也增加，且CD95抗原的表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞的凋亡率呈正相關(guān)。因此，我們推測(cè)CD95信號(hào)通路介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡參與了HZ的發(fā)生。但本次研究只對(duì)急性期HZ病人做了檢測(cè)分析，具有一定的局限性，而發(fā)生PHN的機(jī)制復(fù)雜，影響因素多，有關(guān)CD95介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡與PHN的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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