張 建，黃鳳珍，張 煒，李小軍，李玉桑，唐瀟旖，胡燁胤，商洪才，唐和斌，田貴華

豨紅通絡(luò)口服液是由豨薟草、紅花、川牛膝3味藥材組成的復(fù)方制劑[1]，在臨床上治療瘀血阻絡(luò)所致的中風(fēng)之癥等。復(fù)方制劑中的豨薟草具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、清熱解毒的功效；紅花可活血通經(jīng)、化瘀止痛、活血解毒[2]；川牛膝具有活血化瘀、利尿通淋之作用[3]，對(duì)巴豆油致小鼠耳廓腫脹有良好的緩解效果[4]。亦有報(bào)道指出[5]，豨紅通絡(luò)口服液能夠迅速通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，可對(duì)腦部疼痛發(fā)揮治療作用。腦卒中后中樞性疼痛屬于神經(jīng)病理性疼痛，是中風(fēng)病最為棘手的癥狀之一[6]。因此，本研究擬探討豨紅通絡(luò)口服液對(duì)完全弗氏佐劑等起炎物質(zhì)誘發(fā)的炎性腫脹、炎性疼痛和腦出血誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控規(guī)律，初步評(píng)價(jià)其作用機(jī)制，為進(jìn)一步在臨床上推廣使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用SPF級(jí)昆明雄性小鼠（6～9周齡，體質(zhì)量 18～22 g；合格證編號(hào)：42000600021454），購買自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 藥物與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用的中成藥為豨紅通絡(luò)口服液（吉林省通化衛(wèi)京藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)20170201）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號(hào)1001541106）；醋酸（美國Sigma公司，批號(hào)20170122）；二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)10023418）；IV型膠原酶（美國Sigma公司）；蘇木精（南京建成，批號(hào)20161209）；伊紅（美國Sigma公司，批號(hào)114813194）；甲醛溶液（國藥試劑，批號(hào)20160229）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)10009218）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)10010018）；30%過氧化氫溶液；胰蛋白酶（美國 GIBCO，10270-106）；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，p H 7．2）；兔源 IBA-1 多克隆抗體（美國Millipore，ABN67）；兔源GFAP多克隆抗體（美國Caymen，BA0056）；山羊抗兔Ig G（武漢博士德公司，BA1054）。

1.3 儀器 腦立體定位儀（美國Stoelting，型號(hào)ST-51903）；熱痛儀（美國 Ugo Basile，型號(hào) 37370）；脫水機(jī)（德國萊卡，型號(hào)TP1020）；包埋機(jī)（德國萊卡，型號(hào) EG1150）；冰凍切片機(jī)（德國萊卡，型號(hào)CM3050S）；手持式測(cè)痛儀（北京碩林苑科技有限公司，型號(hào)SLY-HFM）；多光譜成像系統(tǒng)（美國Nuance，型號(hào)N-MSI-FX）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型建立與給藥劑量 1）小鼠耳廓腫脹模型的建立，于小鼠右耳耳廓涂抹50μL二甲苯（Xylene）[7]。2）小鼠炎性疼痛模型的建立，在小鼠左足足底注射50μL完全弗氏佐劑（CFA）[8]。3）小鼠醋酸扭體模型的建立，用注射器腹腔注射0．6%的醋酸（0．01 mL/g）[9]。4）小鼠腦卒中疼痛模型的建立，在腦定位儀于左腦（bregma-0．2 mm，midline 2．0 m m，surface 3．0 mm）注入膠原酶（0．25 μL，0．025 U），造成腦卒中后中樞性疼痛模型[6]。按照4種不同的造模方式，隨機(jī)將各個(gè)模型的小鼠分成正常組、模型組、低劑量治療組（2μL/g）和高劑量治療組（10μL/g），每組5只。

1.4.2 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.2.1 腫脹與疼痛閾值測(cè)定 分別于0或1/48、1、3、5 d檢測(cè)小鼠的疼痛閾值[10]、足趾腫脹和耳廓腫脹程度。

1.4.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色與Nissl染色、免疫組織化學(xué)染色 于第5天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，炎性疼痛模型各組小鼠處死后取左足足底皮膚，進(jìn)行石蠟包埋，行HE染色：觀察組織的炎癥變化情況，每組小鼠選取2張切片，二甲苯脫蠟3次10 min，常規(guī)乙醇梯度脫水，蘇木素核染5 min，溫水返藍(lán)5 min，伊紅質(zhì)染 30 s，封片[11]。

腦卒中模型各組小鼠進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦組織置福爾馬林溶液中固定，進(jìn)行石蠟包埋，行Nissl染色：首先腦組織冰凍切片，蒸餾水2 min，Nissl染色液染色3～10 min，蒸餾水洗滌2次；然后95%的乙醇依次5 s，2 min，2 min脫水；接著二甲苯透明2次，每次5 min，最后用中性樹脂膠封片。

免疫組織化學(xué)染色：每組小鼠任意選2張切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水。滴加0．3%雙氧水室溫30 min，0．1%胰酶室溫1 h，血清封閉40 min后滴加兔抗鼠一抗溶液-4℃保存過夜，加羊抗兔二抗室溫孵育30 min后，DAB發(fā)色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的變化情況，并運(yùn)用多光譜技術(shù)對(duì)免疫組化的結(jié)果進(jìn)行定量分析[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 豨紅通絡(luò)口服液灌胃（每日1次），然后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（1/48 d、1 d、3 d、5 d）進(jìn)行炎性腫脹程度、疼痛行為變化以及受損腦組織病理損傷進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)整體數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的方法對(duì)小鼠耳廓炎性腫脹，足趾炎性腫脹，扭體抑制率，足底機(jī)械痛閾，足底熱痛閾數(shù)據(jù)處理；采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多光譜定量的比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)二甲苯誘發(fā)小鼠耳廓炎性腫脹的影響 通過二甲苯涂抹小鼠耳廓，誘發(fā)了明顯腫脹。耳廓腫脹在第1天達(dá)到峰值（模型組腫脹至空白組的（202．02±5．53）%。而相比模型組小鼠，給予豨紅通絡(luò)口服液低劑量（2μL/g）、高劑量（10μL/g）治療組的耳廓腫脹程度，得到了明顯緩解，并隨著給藥次數(shù)的增加，效果越來越顯著，在第5天時(shí)高劑量治療組治療效果最佳（模型組腫脹至空白組的（202．02±7．14）%，而低劑量和高劑量的治療組分別降至空白組的（162．33±3．27）%與（151．52±8．40）%。見表 1。

表1 各組小鼠耳廓腫脹程度（x±s）Tab.1 Miceauricleswelling（x±s）mm

2.2 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)完全弗氏佐劑誘發(fā)小鼠足趾炎性腫脹的影響 為了確證豨紅通絡(luò)口服液對(duì)炎性腫脹的改善效果，選用完全弗氏佐劑誘發(fā)小鼠足底炎性腫脹模型。見表2。完全弗氏佐劑誘發(fā)了小鼠的足趾炎性腫脹，并在第1天就達(dá)到峰值[模型組腫脹至空白組的（151．77±1．73）%]。相比模型組小鼠，豨紅通絡(luò)口服液低劑量和高劑量灌胃處理的小鼠均有明顯恢復(fù)，且高劑量治療組治療效果較好（模型組腫脹至空白組的（149．89±1．73）%，而低劑量治療、高劑量治療組分別降至空白組的（135．00±1．25）%與（130．15±1．22）%。為觀察小鼠足趾炎性腫脹的真實(shí)性，筆者在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后取下了小鼠雙足，并進(jìn)行固定、包埋、HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠足底部皮膚組織（完全弗氏佐劑注射側(cè)）相較于空白組存在明顯的炎性浸潤(rùn)，豨紅通絡(luò)口服液低劑量和高劑量治療組均有較好的改善。見圖1。

表2 各組小鼠腳趾腫脹程度（x±s）Tab.2 Micetoe swelling（x±s）cm

圖1 小鼠局部皮膚的HE染色Fig.1 HEstaining of local skin

2.3 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)小鼠扭體抑制率的影響 為了觀察豨紅通絡(luò)口服液對(duì)小鼠炎性鎮(zhèn)痛的效果，選用腹腔注射醋酸。模型組相較于空白組出現(xiàn)了由醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體次數(shù)明顯，而豨紅通絡(luò)口服液的低劑量、高劑量治療組隨著給藥時(shí)間的增加，能夠明顯抑制小鼠的扭體次數(shù)，且高劑量治療組治療效果更加顯著。見表3。

表3 各組小鼠扭體抑制率比較（x±s）Tab.3 Mice torsion inhibition rate（x±s）%

2.4 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)腦卒中小鼠足底機(jī)械痛閾的影響 為了確證豨紅通絡(luò)口服液對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經(jīng)性疼痛模型，檢測(cè)小鼠機(jī)械痛閾的情況。實(shí)驗(yàn)小鼠的機(jī)械痛閾在第1天到達(dá)谷值（模型組的痛閾下降至空白組的（43．55±8．57）%），在注入膠原酶之后除空白組其余各組機(jī)械痛閾下調(diào)明顯，而通過豨紅通絡(luò)口服液的灌胃處理，隨著給藥時(shí)間的增加，治療組的機(jī)械痛閾值有所回調(diào)，且高劑量治療效果更佳（模型組的疼痛閾值下降至空白組的（54．83±5．85）%，而低劑量和高劑量治療組則分別回調(diào)至空白組的（62．21±2．56）%與（65．26±3．74）%。見表 4。

表4 各組小鼠足底機(jī)械痛閾（x±s）Tab.4 Mechanical pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.5 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)腦卒中小鼠足底熱痛閾的影響 為了觀察豨紅通絡(luò)口服液對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經(jīng)性疼痛模型，檢測(cè)小鼠足底熱痛閾的情況。實(shí)驗(yàn)小鼠的足底熱痛閾在第1天到達(dá)谷值 [模型組的熱痛閾下降至空白組的（31．91±3．67）%]，在注入膠原酶之后除空白組其余各組足底熱痛閾下調(diào)明顯，而通過豨紅通絡(luò)口服液的灌胃處理，隨著給藥時(shí)間的增加，治療組的足底熱痛閾值回調(diào)明顯，且高劑量治療組治療效果更佳[模型組的熱痛閾下將至空白組的（51．83±5．86）%，而低劑量和高劑量治療組分別回調(diào)至空白組的（70．02±7．35）%與（81．03±8．11%）]。見表 5。

表5 小鼠足底熱痛閾表（x±s）Tab.5 The thermal pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.6 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)腦卒中小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響 為了觀察豨紅通絡(luò)口服液對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經(jīng)性疼痛模型，通過檢測(cè)小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。如圖2所示，從Nissl染色結(jié)果來看，空白組中的尼氏小體的著色深并且形狀比較規(guī)整、數(shù)量較多，而模型組的尼氏小體著色較淺，形狀變得不規(guī)整，并且數(shù)量較少，這說明小鼠注入膠原酶后，腦組織受到了損傷，且神經(jīng)細(xì)胞也受到了一些損傷。低、高劑量豨紅通絡(luò)口服液治療后，觀察到腦組織中尼氏小體的著色增加，炎癥得到很好的緩解。

圖2 小鼠神經(jīng)細(xì)胞Nissl染色圖Fig.2 Nissl staining of mice nerve cells

2.7 豨紅通絡(luò)口服液對(duì)腦卒中小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞異常肥大的影響 為了觀察豨紅通絡(luò)口服液對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經(jīng)性疼痛模型，檢測(cè)小鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞的變化情況（多光譜定量）。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M相比于空白組的膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量異常增多，并且形態(tài)變大、變厚，而本研究豨紅通絡(luò)口服液低劑量和高劑量治療組相較于模型組都呈現(xiàn)出較小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并且數(shù)量也很少。光譜定量的結(jié)果空白組（100.00±2.25）%，模型組（144.53±22.05）%，低劑量治療組（54.84±3.56）%，高劑量治療組（127.27±10.54）%，與空白組的進(jìn)行比較，模型組的膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)顯著性上調(diào)。進(jìn)行豨紅通絡(luò)口服液治療后膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)顯著性下調(diào)，且高劑量治療組治療效果更為明顯。

圖3 小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色圖Fig.3 Immunohistochemical staining of microglia cellsin mice

3 討論

眾所周知，疼痛特別是慢性疼痛（炎性、神經(jīng)病理性疼痛）給患者帶來的傷害是不言而喻的[13]。本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)刺激造模包括腹腔注射醋酸、足底注射CFA及耳廓涂抹二甲苯，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性疼痛，評(píng)價(jià)豨紅通絡(luò)口服液的外周鎮(zhèn)痛效果；以及運(yùn)用腦卒中造模探究豨紅通絡(luò)口服液的中樞性疼痛治療作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)富含川牛膝的復(fù)方制劑豨紅通絡(luò)口服液明顯改善了二甲苯所致的耳廓炎性腫脹和CFA所致的腳趾腫脹。此結(jié)果與史玉芬等[4]在小鼠背部皮下注射牛膝具有改善巴豆油所致耳廓腫脹的抗炎效果一致，表明豨紅通絡(luò)口服液確有良好的抗炎作用。當(dāng)然嚴(yán)重的炎性腫脹通常會(huì)伴隨有異常的疼痛反應(yīng)。而豨紅通絡(luò)口服液既明顯緩解CFA所致的腳趾熱痛閾下降，亦減輕了腹腔注射醋酸所致的扭體疼痛反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了豨紅通絡(luò)口服液具有抗炎鎮(zhèn)痛之療效。

基于豨紅通絡(luò)口服液對(duì)體表炎性腫脹及末梢炎性疼痛反應(yīng)緩解的良好作用，進(jìn)一步以腦卒中模型探究豨紅通絡(luò)口服液對(duì)中樞性神經(jīng)病理性疼痛的治療效果。通過對(duì)受試動(dòng)物腦組織的神經(jīng)細(xì)胞損傷及膠質(zhì)細(xì)胞異常肥大的評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豨紅通絡(luò)口服液不僅能減少腦卒中導(dǎo)致的腦組織中神經(jīng)細(xì)胞損傷及膠質(zhì)細(xì)胞異常肥大，亦緩解了腦損傷引起的痛覺敏化。此結(jié)果與秦秀德等[14]尾緣靜脈注射紅花注射液改善急性腦梗死實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能的缺損，減輕炎癥的報(bào)道相吻合，因?yàn)樨g紅通絡(luò)口服液中也含有紅花這一組分。由此可見適量的豨紅通絡(luò)口服液灌胃給藥能發(fā)揮較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，雖然其詳細(xì)的鎮(zhèn)痛機(jī)制和有效成分仍有待進(jìn)一步的研究，但其確能改善末梢性的炎性疼痛反應(yīng)，也能有效緩解中樞部位神經(jīng)病理性疼痛，有助于指導(dǎo)臨床針對(duì)慢性疼痛患者治療的藥物合理選用。

綜上豨紅通絡(luò)口服液既能快速減輕起炎物質(zhì)誘發(fā)的炎癥腫脹和疼痛反應(yīng)，也能改善腦卒中引起腦組織神經(jīng)細(xì)胞受損及膠質(zhì)細(xì)胞的異常肥大，有效緩解中樞性神經(jīng)病理性疼痛，發(fā)揮良好的抗炎鎮(zhèn)痛之功效。

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