雒明池 ，梁 如 ，高樹明，李 琳 ，高 杉

抑郁癥是一種極度危害人類身心健康的常見精神疾病，常伴有嚴重的并發(fā)癥，嚴重危害人們的健康[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將其列為十大嚴重疾病之一[2]。抑郁癥的高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率迫切要求研究者加速對其發(fā)病機制的研究以及開發(fā)療效更好的抗抑郁藥物[3]。近年來多靶點作用機制逐漸成為抑郁癥研究的熱點和焦點，研究者發(fā)現細胞信號轉導理論更適合闡明抗抑郁藥物的多靶點作用機制。目前，與抗抑郁藥物作用機制相關的細胞信號轉導通路主要涉及cAMP-PKA-CREBBDNF通路、NO-cGMP-PKG通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、IP3/Ca2+DAG/PKC 通路等[4]。第二信使分子cAMP和cGMP成為了現代中醫(yī)藥研究者關注的熱點之一。美國生物學家Goldberg[5]于1975年提出了“陰陽學說與cAMP和cGMP雙向生物調節(jié)關系的假說”，并推論cAMP與cGMP的雙向控制系統(tǒng)能統(tǒng)一許多不同生物調節(jié)現象的原理，即陰陽學說的基本原理所在，這個理論被國內中醫(yī)學者認同[6]。

中醫(yī)古方交泰丸，由黃連：肉桂配伍組成，黃連味苦性寒入心經，可以清降心火以下交腎水；肉桂味辛性熱入腎經，可以溫升腎水以上濟心火，兩藥一寒一熱，一陰一陽，共奏交通心腎，調神定志之功，臨床上常用于治療失眠，更年期綜合癥[8-9]。但近代有研究表明交泰丸具有抗抑郁作用，如錢哲等[10]研究表明交泰丸能夠通過調節(jié)脂多糖（LPS）誘導的小鼠模型的單胺能反應及抗炎作用來緩解治療小鼠的抑郁樣改變。西醫(yī)學研究也證實，黃連中所含的小檗堿具有抗抑郁作用[11-12]。肉桂所含的桂皮醛可以可用作改善抑郁癥和焦慮癥癥狀的輔助療法[13]。本研究將基于cAMP-CREB-BDNF信號通路探討交泰丸抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠，雄性，體質量140～160 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥品與制備 黃連、肉桂飲片（均購自安徽省亳州市藥材總公司中西藥公司）。陽性對照藥物：鹽酸氟西?。ò賰?yōu)解），禮來蘇州制藥有限公司，批號：4482A。交泰丸制備工藝參考課題組前期研究[14]。

1.3 實驗儀器與試劑 萬能粉碎機（浙江屹立工貿有限公司，QE-100克）、超低溫冰箱（中國Haier公司）；開場行為觀察箱、Digibehave雙畫面動物行為視頻分析系統(tǒng)2．1版、水合氯醛、Mouse/Rat cAMP Parameter Assay Kit試劑盒（美國R&D公司）、10×PBS（上海生工生物工程股份有限公司）、蛋白酶抑制劑（德國羅氏試劑公司）、Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133)DuoSet ICELISA試劑盒（美國R&D 公司）、Total BDNF Quantikine ELISA Kit試劑盒（美國R&D公司）、PDE-GloTM Phosphodiesterase Assay（美國 Promega公司）、p-CREB抗體（英國Abcam公司）等。

1.4 實驗分組與給藥 將開場實驗行為比較接近的大鼠72只，隨機分為6組，分別為空白對照組、模型組、陽性藥對照組（鹽酸氟西汀，7．5 mg/kg）和交泰丸低（生藥 0．75 g/kg）、中（生藥 1．5 g/kg）、高（生藥3 g/kg）劑量組，每組12只，分籠飼養(yǎng)。大鼠抑郁模型的建立采用慢性溫和不可預知性應激刺激（CUMS），具體操作參考課題組前期研究[14]，刺激主要包括禁食24 h；禁水24 h，夾尾持續(xù)2 min；晝夜顛倒；振蕩2 min；4℃冷水游泳5 min。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠海馬組織中 cAMP、p-CREB、BDNF、PDE含量以及大鼠血漿中cAMP的含量測定 嚴格按照cAMP試劑盒說明書操作分別測定大鼠血漿及海馬組織中cAMP的濃度；按照p-CREB試劑盒、BDNF試劑盒、PDE活性試劑盒測定大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量及PDE的活性。

1.5.2 大鼠海馬、皮質中BDNFmRNA表達含量測定 參考前期實驗研究方法[15]，根據試劑盒說明，采用Qiagen RNeasy Mini kit試劑盒分別提取大鼠海馬、皮質中mRNA，測定mRNA濃度。逆轉錄合成cDNA：按照反轉錄試劑盒說明冰上操作，合成cDNA于-80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR實驗：應用ABI?7500實時熒光定量PCR儀分析軟件測定BDNFmRNA的表達。反應以β-actin和GAPDH作為內參，引物序列見表1。

1.5.3 大鼠海馬組織p-CREB陽性細胞的表達分析 取大鼠海馬組織石蠟包埋切片，將切片置于3%H2O2溶液中室溫10 min滅活內源性酶，熱修復抗原，滴加一抗（兔抗大鼠 IgG，1∶100），4 ℃孵育 48 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃，20 min。采用 S-P（Streptavidin-perosidase）法染色及DAB顯色。在大鼠海馬CA1、CA3區(qū)，高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，拍照后用Image-Pro Plus6．0專業(yè)圖像分析軟件進行定量分析，測定區(qū)域面積（Area）及積分光密度值（IOD）。計算陽性細胞表達的平均光密度（AOD），以此評價大鼠海馬組織中P-CREB陽性細胞表達情況。AOD=IOD/Area×100%。

表1 RT-PCR引物序列及反應參數Tab.1 RT-PCR primer sequenceand reaction parameters

1.6 統(tǒng)計方法 實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，使用SPSS19．0軟件進行數據統(tǒng)計分析。組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）法，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 交泰丸對CUMS大鼠血漿和海馬組織中cAMP含量的影響 模型組大鼠血漿和海馬組織中cAMP含量均明顯降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥對照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地升高大鼠血漿中和海馬組織中cAMP的含量，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 2。

表2 交泰丸對CUMS大鼠腦海馬組織和血漿中cAMP含量的影響（x±s）Tab.2 Effect of Jiaotaipill on the contents of cAMPin the hippocampusand plasma of CUMSrats（x±s）

2.2 交泰丸對CUMS大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF含量以及PDE活性影響 模型組大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量明顯下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥對照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地升高大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量，與模型組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。模型組大鼠海馬組織中PDE活性明顯升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥對照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地降低大鼠海馬組織中PDE的活性，其中陽性藥對照組、交泰丸中、高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05或P＜0．01）。見表 3。

表3 交泰丸對CUMS大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF含量以及PDE活性的影響（x±s）Tab.3 Effect of Jiaotaipill on the contentsof p-CREB and BDNF and the activity of PDE in thehippocampusof CUMSrats（x±s）

圖1 交泰丸對CUMS大鼠海馬、皮質中BDNF mRNA表達的影響Fig.1 Effect of Jiaotaipill on theexpression of BDNF mRNA in the hippocampusand cortex of CUMSrats

2.3 交泰丸對CUMS大鼠海馬、皮質中BDNF mRNA表達的影響 以GAPDH作為內參引物時，模型組大鼠海馬、皮質中BDNFmRNA表達顯著降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥對照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調大鼠海馬、皮質中BDNF mRNA的表達水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05或P＜0．01）。以β-actin作為內參引物時，模型組大鼠海馬、皮質中BDNF mRNA表達顯著降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥對照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調海馬、皮質中BDNFmRNA的表達水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05 或 P＜0．01)。見圖 1。

2.4 交泰丸對CUMS大鼠海馬組織p-CREB陽性細胞表達影響 在大鼠腦內海馬組織CA1區(qū)中，模型組大鼠p-CREB陽性細胞表達顯著降低，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0．01）。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調海馬組織中p-CREB細胞的表達水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。在大鼠腦內海馬組織CA3區(qū)中，模型組大鼠p-CREB陽性細胞表達顯著降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調海馬組織中p-CREB細胞的表達水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。見圖2。

3 討論

圖2 交泰丸對CUMS大鼠腦內海馬組織p-CREB陽性細胞表達影響（×400）Fig.2 The effect of Jiaotaipill on the expression of p-CREB positive cellsin the hippocampusof CUMSrats(×400)

本研究中采用CUMS建立大鼠抑郁癥模型，此模型所展現出來的行動減少，興趣缺乏以及快感缺失等抑郁狀態(tài)，被認為與臨床診斷為抑郁癥的患者所展現出的精神運動改變、興趣和快感的喪失有著密切的關系[16]，是與臨床實際最為貼切、最具代表性的抑郁癥模型，有研究表明其相當于現代生活中3周左右的社會生活壓力[17]。CUMS模型最早由Katz等提出，它被用于評估抗抑郁癥藥物的療效，臨床上幾乎所有對于抑郁癥有效的藥物均可以在不同程度上逆轉CUMS模型中抑郁樣改變，據此說明該動物模型具有較好的預測性，而本課題組前期的研究[14]也表明交泰丸能夠逆轉CUMS大鼠的抑郁樣改變。

目前cAMP-CREB-BDNF細胞信號轉導通路是研究最早、最為深入的抗抑郁藥物信號轉導通路之一，經早期研究顯示自殺死亡的抑郁癥患者前額皮質cAMP含量有所降低，重癥抑郁癥患者尸體解剖研究顯示其腦內海馬CREB磷酸化水平均明顯下降[18]。cAMP-CREB-BDNF信號轉導通路被認為是抑郁癥神經元再生關鍵性環(huán)節(jié)之一，與大腦的空間記憶以及學習功能相關[19]。在抑郁治療過程中，CREB不僅能增強顆粒細胞神經元的整合和功能的可塑性，且可直接調控BDNF的合成及轉錄，BDNF是調節(jié)神經元活動最重要基因之一[20]，參與軸突再生、樹突生長和突觸可塑性的調節(jié)，促進海馬神經再生，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。PDE作為抑制劑工具可通過上調cAMP-CREB-BDNF信號轉導通路而起到改善認知功能、抗焦慮及抗抑郁的作用[21]。研究中通過檢測抑郁癥大鼠海馬組織及血漿中cAMP的含量變化和大鼠海馬中p-CREB、BDNF含量的變化，以及大鼠海馬組織中BDNFmRNA的表達情況。結果發(fā)現交泰丸干預治療抑郁癥大鼠后，大鼠海馬組織及血漿中的cAMP和海馬組織中p-CREB、BDNF含量均明顯上升，進一步研究顯示在大鼠海馬、皮質中BDNF mRNA均出現高表達，同時降低了PDE活性明顯降低，逆轉了CUMS大鼠海馬組織CA1、CA3區(qū)的改變。綜上說明交泰丸可通過調節(jié)cAMP-CREB-BDNF細胞信號傳導通路的表達來達到抗抑郁的目的。

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