左春霞，張勉之，賈勝琴

局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）是一種常見、難治的腎小球病，最終可導致終末期腎病（ESRD）。大量研究提示其起病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是各類原因引起的腎臟足細胞受損[1]。因而，目前防治FSGS的中心問題是保護足細胞正常的數(shù)量和功能。目前單獨應(yīng)用西藥治療FSGS不能取得確切滿意的療效，并且長期使用西藥不良反應(yīng)大、經(jīng)濟負擔重，所以中藥治療可能成為FSGS治療的重要途徑之一。張大寧教授[2]根據(jù)多年臨床實踐，將補腎活血中藥組方廣泛應(yīng)用于腎臟病的臨床治療中，可補腎氣、活血化瘀。在本課題中系統(tǒng)分析了補腎活血法組方調(diào)節(jié)FSGS模型小鼠足細胞特異性蛋白分子骨架蛋白desmin、腎母細胞瘤wt1和裂孔膜蛋白nephrin，并探討該組方針對FSGS足細胞產(chǎn)生保護作用的內(nèi)在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用24只雄性且清潔級的BALB/c小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量 22～26 g，尿蛋白均陰性，購自軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。采用隨機數(shù)字表法隨機分為3組，即正常對照組（n=5）、模型組（n=10）以及治療組（n=9）。

1.2 試劑和藥物制備 阿霉素從美國Sigma公司購得，制成1 mg/mL的溶液[用生理鹽水（廣州利泰制藥股份有限公司生產(chǎn)）配制]；天津藥物研究院制備補腎活血組方醇提液，將從天津太平大藥房購得的五味子、茵陳蒿、生黃芪、川芎、大黃炭、大黃、丹參、五靈脂以及半枝蓮等草藥，用天津百世化工有限公司購買的90%乙醇經(jīng)過3 h加熱回流之后，先后提取2次，并將提取液進行合并，在靜置之后實施過濾，并將乙醇減壓回收，濃縮獲得浸膏，置于-20℃環(huán)境下留存待用[3]。從美國Santa Cruz公司購得的免疫熒光封閉液、一抗山羊抗鼠nephrin等，從北京中山生物技術(shù)公司購得二抗兔抗山羊多克隆抗體，從日本Takara公司購得總RNA提取試劑盒、電泳瓊脂糖以及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，從美國Bio-Rad公司購得PCR擴增儀，及臺式高速離心機以及凝膠成像系統(tǒng)，從上海生工生物公司購得引物并合成。

1.3 構(gòu)建動物模型[4]將3組小鼠先進行常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)，時間為7 d，然后針對模型組和治療組實施尾靜脈注射ADR 10 mg/kg，而空白對照組則是注射同樣體積的生理鹽水；在7 d之后，考馬斯亮藍法驗證尿白蛋白顯著增多者納入實驗。針對治療組使用10μL/（g·d）補腎活血組方進行灌胃，并在每周按照所測到的體質(zhì)量作出適當?shù)膭┝空{(diào)整，而模型組以及空白對照組則是灌胃同樣體積純凈水。每日給藥1次，時間固定為上午10點，持續(xù)6周。中間因有死亡，予以剔除。在實驗結(jié)束的時候，模型組與治療組都各自剩下6只小鼠，而空白對照組則沒有變化。

1.4 標本收集和處理 在實驗即將結(jié)束之前以電子天平對所有小鼠進行體質(zhì)量稱量，并將血、尿等收集起來，以高效液相色譜法完成尿肌酐以及尿白蛋白的濃度測定，同時求解到24 h尿蛋白排泄率（UAER）和尿白蛋白/肌酐比值（UACR），公式為：

UAER=尿白蛋白（mg/L）×24 h尿量（L）

UACR=尿白蛋白（mg/L）×尿量（L）/[尿肌酐（mmol/L）×尿量（L）]。

采用腹腔注射戊巴比妥鈉的方式對小鼠實施麻醉處理，將左腎取下來，并對腎皮質(zhì)進行分離，切下前段1/3組織固定在中性福爾馬林里面，持續(xù)時間為24h，然后實施脫水、包埋以及切片（3μm），并進行蘇木精-伊紅（HE）、高碘酸-甲烷氨銀（PASM）常規(guī)染色；中段1/3以包埋劑實施包埋，然后進行冰凍切片，通過免疫熒光完成檢測；剩下1/3則放到液氮里面，置于-80℃冰箱當中冷凍，實施PCR檢測。

1.5 觀察腎組織形態(tài) 石蠟包埋之后3μm切片，然后進行常規(guī)脫蠟處理，實施HE、PASM常規(guī)染色，在光鏡之下對腎組織形態(tài)具體變化情況進行觀察，然后進行輕度復(fù)染，待脫水與透明處理之后，以中性樹膠實施封片。

1.6 免疫熒光染色 通過間接免疫熒光法針對腎組織當中對應(yīng)的nephrin表達情況進行檢測。將冰凍切片從-80℃取出后-20℃放置15 min，然后在室溫環(huán)境下靜置15 min，冷凍甲醛并進行10 min穿透固定，以TBST反復(fù)2次清洗，在2%牛血清白蛋白當中以室溫環(huán)境封閉1 h，然后添加一抗，于4℃冰箱當中過夜保存。在等滲鹽溶液當中添加Tris-HCl緩沖液（T BST），清洗3次，每次10 min，然后在二抗當中孵育，于室溫環(huán)境之下避光靜置1 h，接著是以4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，之后是以TBST清洗3次，每次10 min，以水溶性封片劑進行封片處理，放到熒光顯微鏡之下觀察其中nephrin表達情況。

1.7 Wt1、desmin mRNA表達檢測 以Trizol試劑盒于腎臟組織里面提取到總mRNA，以紫外分光光度儀完成mRNA含量與純度水平的檢測。以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實施逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，放到瓊脂凝膠里面進行電泳，待凝膠成像之后將GAPDH當成內(nèi)參，實施Image J分析，以擴增片段與GAPDH之間的灰度比來顯示產(chǎn)物數(shù)量，完成半定量處理。在逆轉(zhuǎn)錄方面使用兩步反轉(zhuǎn)法：在70℃環(huán)境下靜置10 min，置于冰上2 min；添加Rnase與M-MLV之后，放到42℃環(huán)境下留存1 h，置于70℃環(huán)境下10 min，放到冰上靜置。PCR環(huán)境：在94℃條件下變性30 s，在60℃環(huán)境下退火處理，時間為30 s，在72℃環(huán)境下進行延伸，時間為1 min。引物序列具體可見表1。

表1 目的基因及內(nèi)參照基因引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene and internal refenrence gene

1.8 統(tǒng)計學分析 以SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素分析，組間兩兩比較采用LSD法，兩兩對比是以LSD-t檢驗為主，P＜0．05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析 在開展實驗過程當中，模型組與治療組都表現(xiàn)出不同程度的攝食與尿量降低、活動遲緩、精神不振、體表水腫以及毛色不光澤等現(xiàn)象，其中的模型組癥狀更加顯著。

2.2 3組體質(zhì)量、血清白蛋白（ALB）、尿蛋白定量和UACR對比 補腎活血法組方治療組體質(zhì)量、血漿ALB 高于模型組（P＜0．01）；補腎活血法組方治療組UAER、UACR 顯著高于模型組（P＜0．01），見表 2。

2.3 腎組織形態(tài)學變化

2.3.1 HE染色結(jié)果 觀察6周末3組腎組織，空白對照組基本正常，腎小球毛細血管開放完好，未見硬化。模型組小鼠的腎小球系膜基質(zhì)出現(xiàn)顯著性增生，并呈現(xiàn)出纖維化，有一些腎小球血管袢與腎小球囊出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。治療組小鼠系膜基質(zhì)所呈現(xiàn)出的纖維化程度較低，具體可見圖1。

2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚酶鏈反應(yīng)（PASM）染色結(jié)果 空白對照組腎組織腎小球的形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本正常，模型組見腎小球基底膜增厚，節(jié)段性硬化，治療組病變減輕，見圖2。

表2 3組ALB、體質(zhì)量、尿蛋白定量和UACR對比（x±s）Tab.2 Comparison of body weight,ALB,UAER and UACR in three groups（x±s）

圖1 3組HE染色比較（×400）Fig.1 Pathological changes of renal tissues in three groups(×400)

2.4 免疫熒光結(jié)果 nephrin免疫熒光表達情況：對照組足細胞的Nephrin因子沿毛細血管緊密分布；其在FSGS組表達明顯減弱，散布不均，且局部表達缺失；在腎小球毛細血管區(qū)域，較模型組，治療組的nephrin表達也明顯增加，具體可見圖3。

圖2 3組PASM染色比較（×400）Fig.2 Pathological changesof renal tissuesin threegroups(×400)

2.5 RT-PCR結(jié)果 在模型組小鼠當中，其wt1表達程度比對照組與治療組低，而desmin mRNA表達程度則比對照組與治療組高，其中的差異具備顯著性（P＜0．01），可見圖 4。3 組 desmin、wt1 與 GAPDH的PCR條帶光密度比值，可見表3。

3 討論

圖2 3組nephrin陽性表達情況（免疫熒光×200）Fig.3 The positive expressionsof nephrin in three groups(immunofluorescence×400)

圖4 3組desmin、wt1 mRNA表達的變化Fig.4 Renal mRNA expressionsof desmin and wt1 in three groups

表3 3組desmin、wtl mRNA和GAPDH條帶光密度比值對比（x±s）Tab.3 The mRNA expression of desmin and wt1 in three groups（x±s）

鹽酸阿霉素能抑制細胞周期各個階段DNA及RNA的合成，產(chǎn)生巨大的細胞毒作用[5]，它可作用于腎小球濾過膜發(fā)生蛋白尿。大量的蛋白尿間接刺激腎小球系膜細胞增殖和系膜基質(zhì)增多，形成腎小球硬化[6]。另外，阿霉素及其代謝產(chǎn)物導致足細胞足突融合和足細胞減少，導致蛋白尿，發(fā)展為腎小球硬化，形成與人類FSGS類似的病變[7]。本實驗用阿霉素誘導產(chǎn)生經(jīng)典的足細胞損傷的FSGS動物模型。

3.1 Wt1在FSGS模型中的表達及意義 近年來的相關(guān)研究結(jié)果顯示，wt1和部分腎小球疾病蛋白尿形成、發(fā)展有關(guān)聯(lián)。毛細血管內(nèi)皮細胞、基底膜及足細胞3部分組成腎小球濾過膜。濾過膜的機械屏障及電荷屏障功能異常，可發(fā)展為大量蛋白尿[8]。研究表明，作為足細胞功能當中的一項關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，wt1降低之后可能會引發(fā)新月體腎小球腎炎以及硬化癥狀。Ohtaka等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS受損的足細胞wt1的表達會減弱。本研究通過HE染色和PASM染色可見模型組腎小球基質(zhì)增生，出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)，通過RT-PCR研究了wt1的表達，發(fā)現(xiàn)wt1在模型組腎組織的表達顯著減少，說明wt1缺失與FSGS密切相關(guān)。

3.2 nephrin在FSGS模型中的表達及意義 研究表明，足細胞損傷可表現(xiàn)為nephrin表達變化[10]。袁軍等[11]報道在阿霉素誘導的腎病動物實驗中，nephrin表達的降低與蛋白尿的產(chǎn)生具有相關(guān)性。有文獻研究報道，在FSGS情況下，nephrin表達水平與正常對照組相比有明顯降低，且nephrin的表達量與24 h尿蛋白定量呈負相關(guān)[12]。本課題研究發(fā)現(xiàn)：FSGS模型組UARE、UACR高于空白對照組，ALB低于空白對照組，由此推斷模型組nephrin在腎小球足細胞中表達降低，腎小球基底膜受損，導致大量蛋白尿。同時實驗還進行了nephrin免疫熒光以及基因表達分析，結(jié)果顯示模型組nephrin表達顯著性降低；從HE染色和PASM染色看到了，與空白對照組和治療組比，模型組的腎小球基質(zhì)增生伴纖維化程度明顯嚴重，因而推斷腎組織nephrin的表達數(shù)量減少可能與FSGS的發(fā)生相關(guān)。

3.3 desmin在FSGS模型中的表達及意義 正常生理情況下，desmin僅少量存在于足細胞中。足細胞損傷，其細胞骨架混亂，在足細胞desmin大量表達[13]。有研究報道，F(xiàn)SGS腎組織內(nèi)desmin表達較正常明顯增強，與尿蛋白呈正相關(guān)，與內(nèi)生肌酐清除率呈負相關(guān)，在足細胞受損FSGS蛋白尿的發(fā)生機制以及腎功能衰退的病程中desmin扮演關(guān)鍵作用[14]。本課題研究顯示：模型組desmin mRNA明顯超過空白對照組，而尿蛋白也有顯著性提升。由此可見，模型組出現(xiàn)了嚴重足細胞損傷現(xiàn)象，導致腎小球濾過屏障被損壞，由此滲出蛋白尿，desmin表達水平和足細胞破壞之間具備密切關(guān)聯(lián)。

3.4 補腎活血組方治療FSGS內(nèi)在機制分析 補腎活血法是由張大寧教授首先提出的。他在多年的臨床實踐中總結(jié)，包括FSGS在內(nèi)的大多腎病患者均存在不同程度的“腎虛與血瘀”，“補腎活血法”其理論核心為腎虛血瘀論，認為腎小球系膜細胞的增殖、ECM的積聚是由于久病腎虛、久病血瘀所至，以補腎活血法為依據(jù)的組方中藥具有補腎、活血、軟堅的功效，改善腎虛血瘀的病理變化，使機體的陰陽平衡、邪去正存[15]。另外，F(xiàn)SGS病程長，多應(yīng)用激素治療，如果長時間服用則容易出現(xiàn)陰虛火旺，所以辨證多為氣陰兩虛，且兼有虛火與癖血，屬于典型的本虛標實。在臨床治療中應(yīng)做到虛實兼顧[16]。綜上所述，補腎活血化瘀法是FSGS治療的主線。補腎活血方依據(jù)中醫(yī)補腎活血法原理，以“腎虛血瘀證”的表現(xiàn)作為基礎(chǔ)而擬定，在實踐當中以溫陽、補腎、益氣、活血、行氣以及滋陰等方法進行培本、扶正、活血以及祛邪。根據(jù)現(xiàn)代藥理學實驗可知，通過使用大劑量黃芪[17]以及五味子[18]可顯著減輕腎損害的臨床癥狀，減少蛋白尿。丹參、川芎、五靈脂等可抑制血小板凝聚，改善微循環(huán)，達到抗凝、抗變態(tài)反應(yīng)和抗炎等功效[19]。茵陳蒿、半枝蓮有抗炎、抗病毒作用功效，且具有抑制抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生的作用。補腎活血組方多味中藥安全合理配伍能改善內(nèi)環(huán)境，增強機體免疫功能，利于損傷腎組織得到修復(fù)。

在本次實驗當中所得到的結(jié)果和模型組對比，以補腎活血方進行為期6周時間的治療之后，小鼠的精神活動狀態(tài)以及進食情況等都出現(xiàn)一定改善，同時體質(zhì)量以及ALB都有所增加，而UARE、UACR則有所降低。通過HE與PASM常規(guī)染色能夠發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠的纖維性沉積有顯著性減弱；腎小球當中的nephrin熒光強度有所上調(diào)；通過PCR檢測到wt1 mRNA表達增多，desmin mRNA表達有所降低。由此可見，補腎活血方可以有效調(diào)節(jié)FSGS狀態(tài)下足細胞desmin、wt1以及nephrin表達水平，保護了受損的足細胞，使尿蛋白減少，從而起到了減輕FSGS進展的作用。

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