肖澤云 ,李 凱 ,2,李愛秀 ,3
艾滋?。ˋIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種復(fù)雜疾病,其治療一直是醫(yī)學(xué)難題。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒,變異性強(qiáng),在使用單靶點藥物治療AIDS的過程中,病毒容易產(chǎn)生耐藥[1]。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對復(fù)雜疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)AIDS等復(fù)雜疾病由多因素共同作用,其病理過程涉及多個細(xì)胞信號分子,僅針對單一細(xì)胞信號分子難以起到良好的治療效果。多靶點藥物能夠多途徑調(diào)節(jié)疾病的信號通路,同時作用于復(fù)雜疾病的多種細(xì)胞信號分子,提高治療效果[2-3]。目前,臨床上采用多藥多靶點藥物即“雞尾酒”療法(HAART)治療AIDS。但多藥聯(lián)用毒副作用更大,容易引起不良反應(yīng),患者的依從性較差[1]。加之病毒交叉耐藥的產(chǎn)生,影響了HAART的治療效果,新型抗HIV藥物的研發(fā)依然緊迫。與多藥多靶點藥物相比,單藥多靶點藥物為單一化學(xué)實體,藥代動力學(xué)性質(zhì)更好掌握,并且能夠減少交叉耐藥的發(fā)生。目前,雖然尚未有HIV單藥多靶點抑制劑進(jìn)入臨床研究階段,但單藥多靶點藥物已成為抗HIV創(chuàng)新藥物的重要思路。
天然產(chǎn)物數(shù)量巨大,種類繁多,是研發(fā)新藥和尋找先導(dǎo)化合物的重要來源。目前,在針對AIDS的天然產(chǎn)物研究中,發(fā)現(xiàn)了其中不乏對HIV病毒具有抑制作用的化合物。前期,總結(jié)了來源于天然產(chǎn)物的HIV單藥多靶點抑制劑,這些抑制劑按照結(jié)構(gòu)可以分為黃酮類、三萜及其苷類、苯丙素類、蛋白和肽類等,其中數(shù)量較多是黃酮類化合物,包括:蛇葡萄素(Ampelop sin)、燈盞花乙素(S cutellarin)、黃芩素(B aicalein)等[4]。這些抑制劑大多是針對HIV整合酶(IN)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和核糖核酸酶 H(RNase H),以作用于IN鏈轉(zhuǎn)移抑制劑 (INSTI)作用位點和RT非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)結(jié)合部位的雙靶點抑制劑[RT(N NRTI)/IN]居多。因此,天然產(chǎn)物對于HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的開發(fā)具有重要意義。
虛擬篩選[5]是指在計算機(jī)上,運(yùn)用分子模擬技術(shù)和CADD方法,尋找與受體具有一定親和力的小分子化合物,以提升篩選效率,縮短研發(fā)周期。選擇3-OHHEPT類HIV R T(N NRTI)/IN雙靶點抑制劑[6-7]展開研究,構(gòu)建針對HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的分子相似性搜索模型,建立NNRTI和RT以及INSTI和IN對接模型[8-10],并基于兩種篩選策略分別對TCMD[11]進(jìn)行虛擬篩選:策略一,先后利用相似性搜索、利平斯基五規(guī)則和分子對接對TCMD逐步篩選,根據(jù)分子對接的打分高低排序;策略二,前期研究中基于所建的HIV R T(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑六點藥效團(tuán)模型和利平斯基五規(guī)則對TCMD進(jìn)行篩選,得到數(shù)據(jù)庫TCMD-SearchMD[10],再基于分子對接對TCMD-SearchMD進(jìn)行篩選,根據(jù)打分高低排序。然后,將這兩種策略篩選出的小分子化合物進(jìn)行整理分析,以期從中發(fā)現(xiàn)潛在的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑。
1.1 軟件 分子模擬與分子設(shè)計軟件包MOE2009.10[12]和 SYBYL8.1[13]。
1.2 數(shù)據(jù)庫 TCMD2003.1[11],包括9 127個化合物結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息;本研究前期對TCMD篩選得到數(shù)據(jù)庫TCMD-SearchMD[10],包括229個化合物結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息。
1.3 受體結(jié)構(gòu) 從蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)下載1JLA[14],為RT與HEPT類NNRTITNK-651的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),實驗室基于IN與5ClTEP復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)1QS4 構(gòu)建的理論模型 1QS4(2Mg2+)[15]。
2.1 分子相似性搜索模型的構(gòu)建 本研究分別選擇 TNK-651[16]和已知 3-OH HEPT類 HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑[6-7]中活性較高的化合物1、2(見表1)為模板分子,在MOE相似性搜索模塊分別設(shè)定相似性系數(shù)(Tani moto coefficient)為45%、50%和60%,對TCMD進(jìn)行篩選,比較不同相似性系數(shù)命中的化合物,進(jìn)而確定模板分子和對應(yīng)的相似性系數(shù)。Molecular fingerprinting計算方法設(shè)定為MACCS,F(xiàn)orce field 為 MMFF94x。
2.2 構(gòu)建分子對接模型
2.2.1 配體準(zhǔn)備 分別將配體分子TNK-651和5ClTEP從1JLA和1Q S4(2Mg2+)中抽提出來,在SYBYL配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備模塊(li gand structure preparatio n)對配體分子進(jìn)行加氫和能量優(yōu)化。參數(shù)Force field選擇 Tripos,Method 為 Powell,Termination 為 Gardient 0.001 kcal/(mol·?),Max Iterations為10 000。
2.2.2 受體準(zhǔn)備 受體準(zhǔn)備在SYBYL Surflex-Dock蛋白結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備模塊(prepare protein structure)完成,首先將1JLA和1QS4(2Mg2+)配體分子TNK-651和5ClTEP抽提出來,保留A鏈,刪除結(jié)晶水,對氨基酸殘基進(jìn)行加氫。然后,分別以1JLA和1QS4(2Mg2+)中配體的坐標(biāo)為中心生成Protomol即結(jié)合口袋,保存結(jié)果用于后續(xù)研究。
表1 模板化合物的結(jié)構(gòu)及活性數(shù)據(jù)Tab.1 Structureand activity data of templatecompounds
2.2.3 分子對接 為確定RT和NNRTI以及IN和INSTI最佳對接參數(shù),在SYBYLSurflex-Dock模塊,將配體分子TNK-651和5ClTEP分別對接回RT和IN活性位點。選擇標(biāo)準(zhǔn)模式對接,設(shè)定TNK-651的結(jié)晶構(gòu)象和5ClTEP結(jié)合構(gòu)象為參比分子。調(diào)整對接參數(shù)設(shè)置,使配體分子對接構(gòu)象最大程度重現(xiàn)復(fù)合物結(jié)構(gòu)中配體分子原構(gòu)象。一般以配體分子對接構(gòu)象與復(fù)合物中結(jié)晶構(gòu)象之間的均方根偏差(RMSD)值作為判斷標(biāo)準(zhǔn),當(dāng) RMSD≤2.0? 時,對接能夠較好地重現(xiàn)出原配體分子的空間位置及構(gòu)象。
2.3 數(shù)據(jù)庫搜索 TCMD庫中包含9 127個化合物,為加快篩選速度,提高陽性率,制定兩種篩選策略[17]。策略一:(1)運(yùn)用構(gòu)建的分子相似性搜索模型對TCMD進(jìn)行篩選,設(shè)定化合物2為模板化合物,相似性系數(shù)為50%。(2)利用利平斯基五規(guī)則進(jìn)行類藥性分析。(3)將(2)篩選得到的化合物分別與RT和IN活性口袋對接。策略二:將TCMDSearchMD中化合物分別與RT和IN活性口袋對接,對接采用篩選模式,參數(shù)設(shè)置與上文2.2一致。
3.1 分子相似性搜索模板分子和相似性系數(shù) 在構(gòu)建分子相似性搜索模型的過程中,分別以TNK-651和化合物1、2為模板分子,選擇相似性系數(shù)為60%、50%、45%對TCMD進(jìn)行搜索,結(jié)果顯示,比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)相似性系數(shù)為50%時,命中化合物的數(shù)量適中,用于下一步分子對接篩選。而化合物2活性較高,且對RT和IN抑制活性更為均衡。綜合考慮,本研究選擇以化合物2為模板分子,相似性系數(shù)為50%的分子相似性搜索結(jié)果用于后續(xù)研究。見表2。
表2 模板分子相似性搜索結(jié)果Tab.2 Similarity search results of template compounds
3.2 分子對接模型和參數(shù) 本研究分別構(gòu)建NNRTI和RT活性位點以及INSTI和IN活性位點對接模型,通過調(diào)整對接參數(shù),使配體和酶達(dá)到最合理的相互作用。結(jié)果顯示,TNK-651與RT對接得分為10.60,對接構(gòu)象與1JLA中結(jié)晶構(gòu)象空間距離的RMSD值為0.977?。5ClTEP與IN對接得分為3.98,對接構(gòu)象與1QS4(2Mg2+)中原構(gòu)象空間距離的RMSD值為1.187???梢钥闯?,空間距離的RMSD值均在2?以下,提示對接構(gòu)象比較完整地重現(xiàn)了配體分子原構(gòu)象的空間位置,程序適用,參數(shù)設(shè)置合理。對接參數(shù)設(shè)置如下:Maxconformationsper Fragment為 20,Minimum RMSD Between Final Poses 為0.05?,Maximum Number of Poses per Ligand 為 20。
3.3 篩選結(jié)果
3.3.1 基于策略一的篩選結(jié)果 本研究將相似性搜索命中的152個化合物利用利平斯基五規(guī)則篩選,命中100個小分子。100個小分子中51個與IN對接打分大于4,有43個與RT對接打分大于4,與IN和RT對接打分均大于4的有28個。其中,與IN對接打分大于6的有8個,與RT對接打分大于6的有14個,與IN和RT對接打分均在6以上的有7個。見表3。
3.3.2 基于策略二的篩選結(jié)果 將TCMDSearchMD中小分子分別與IN和RT進(jìn)行對接,與IN對接打分在4以上的有158個,與RT對接打分在4以上的有195個,與IN和RT對接打分均大于4的有143個;其中,與IN對接打分在6以上的有47個,與RT對接打分在6以上的有121個,與IN和RT對接打分均大于6的小分子有29個。見表4。
表3 基于策略一篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.3 Thedoubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy onescreening hit
3.3.3 綜合篩選結(jié)果和理論驗證 綜合篩選結(jié)果,除去1個相同的生物堿類化合物M7351,得到35個潛在 HIV R T(N NRTI)/IN雙靶點抑制劑,與 RT和IN對接得分均大于6,對抑制劑的結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行總結(jié),包括黃酮類(15個)、生物堿類(8個)、多酚類(3個)、苯丙素類(3個)、苷類(3個)、有機(jī)酸類(2個)和醌類(1個),黃酮類化合物占到了42.86%,包括蛇葡萄素、麝香草素、車前子苷等,而策略一對TCMD篩選命中的7個化合物全部為生物堿類。與RT和IN對接結(jié)合較好的化合物蛇葡萄素結(jié)構(gòu)如圖 1(a)所示,圖 1(b,c)為其與 RT 活性位點相互作用2D、3D示意圖,可以看出除疏水相互作用外,蛇葡萄素糖環(huán)3-OH與Lys101、Lys103之間形成氫鍵相互作用,糖環(huán)1-位苯環(huán)與Tyr188之間形成π-π相互作用。觀察蛇葡萄素與IN活性位點相互作用[見圖 1(d、e)],可以看出其與 IN 之間除存在疏水相互作用和氫鍵相互作用外,還通過氨基酸殘基Asp64和Asp116共同與雙Mg2+發(fā)生金屬離子螯合作用。
不同的篩選方法具有各自的針對性和優(yōu)缺點,每種方法均有可能漏篩。本研究通過兩種策略對TCMD進(jìn)行篩選,每種策略既可以篩選到相同的化合物,也可以篩選到不同的化合物。采用兩種策略,能夠相互補(bǔ)充,避免漏篩。TCMD庫包含9 127個化合物,本研究首先采用相似性搜索和藥效團(tuán)篩選,接著運(yùn)用利平斯基五規(guī)則分析,得到的小分子分別與RT和IN進(jìn)行對接,最終保留潛在的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑。已有研究表明,利用Surflex-Dock程序進(jìn)行分子對接,打分>4時配體與受體之間存在較強(qiáng)的相互作用,打分>6則可以預(yù)測配體對受體的抑制活性達(dá)微摩爾級。為加快新藥發(fā)現(xiàn)的速度和減少不必要的浪費,本研究優(yōu)先選擇與RT和IN對接打分均大于6的化合物進(jìn)行分析,以確定率先展開實驗研究的化合物。從數(shù)量上看,命中的黃酮類化合物占到了42.86%,是開發(fā)潛在HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的主要來源,與文獻(xiàn)報道天然產(chǎn)物中HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑中黃酮類化合物居多一致。
表4 基于策略二篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.4 Doubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy two screening hit
本研究的篩選結(jié)果與其他研究者實驗研究也有契合點,如實驗表明杜仲提取物能夠抑制HIVgp41六螺旋結(jié)構(gòu)的形成,是潛在的HIV抑制劑[18],本研究篩選得到來源于杜仲的酚類化合物Koaburaside,Koaburaside具有潛在的HIV RT和IN抑制活性,可能是杜仲提取物抗HIV的物質(zhì)基礎(chǔ)??鄥⒅械狞S酮類化合物苦參新醇H(K ushenol H)具有弱抗單純性皰疹病毒HSV-1和HSV-2活性[19],本研究篩選結(jié)果顯示其與HIV RT和IN對接打分均大于6,預(yù)測對RT和IN抑制活性在微摩爾級。此外,化合物蛇葡萄素能抑制HIV的感染,還能干擾HIV對CD4+細(xì)胞的黏附[20],本研究對接結(jié)果表明蛇葡萄素與RT和IN結(jié)合較好,并與活性位點之間形成了關(guān)鍵相互作用,表明其可能是通過作用于HIV RT和IN,發(fā)揮抗HIV活性。
圖1 蛇葡萄素結(jié)構(gòu)式(a);與RT相互作用2D圖(b);與RT相互作用3D圖(c);與IN相互作用2D圖(d);與IN相互作用3D圖(e)Fig.1 Structure of Ampelopsin(a);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(b);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(c);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(d);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(e)
綜上,本研究運(yùn)用分子模擬技術(shù)和CADD方法構(gòu)建了針對TCMD的虛擬篩選模型和策略,檢出35個潛在的HIV R T(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑,為天然產(chǎn)物來源的HIV雙靶點藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和發(fā)展方向。
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