邵 青 蔣永光 雷安平 胡章立 王江新

(1. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院， 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 深圳 518060；2. 中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系， 武漢 430074)

裸藻(Euglena)是單細(xì)胞的真核藻類， 沒有細(xì)胞壁， 外側(cè)由原生質(zhì)膜包裹， 頂端生有鞭毛， 可以自由游動(dòng)。裸藻細(xì)胞具有完整葉綠體， 在光下能夠通過光合作用進(jìn)行自養(yǎng)生長， 在無光照的條件下也可以利用外界有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長[1]。由于細(xì)胞具有感光的眼點(diǎn)結(jié)構(gòu)， 在原生動(dòng)物學(xué)研究中又稱為“眼蟲”；分子系統(tǒng)學(xué)的研究也表明， 裸藻與致病性寄生蟲錐蟲(Trypanosomes)和利士曼原蟲(Leishmania)具有較近的親緣關(guān)系[2]。因此， 裸藻具有植物和動(dòng)物的雙重特性。裸藻細(xì)胞核具有間核性質(zhì)， 在細(xì)胞分裂過程中， 核膜和核仁均不消失， 染色體保持濃縮狀態(tài)， 是一種介于真核和原核之間的類型。裸藻的葉綠體由兩層葉綠體膜和一層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包圍， 這種三層膜結(jié)構(gòu)表明裸藻葉綠體起源于內(nèi)共生的原始綠藻[3]。與其他具有葉綠體的藻類或高等植物不同，裸藻葉綠體穩(wěn)定性較差， 在抗生素等脅迫條件下易丟失[4]。因此， 裸藻具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)地位， 是研究真核生物進(jìn)化和葉綠體內(nèi)共生的良好材料， 具有重要的科研價(jià)值。

纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)是裸藻屬中研究最多的一個(gè)模式種， 細(xì)胞呈橢球狀或球狀， 形態(tài)可變，長31—40 μm， 寬9—14 μm。纖細(xì)裸藻細(xì)胞富含多種維生素、氨基酸和多不飽和脂肪酸， 具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[5]。2013年10月， 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布公告， 批準(zhǔn)裸藻等作為新食品原料。裸藻生長過程中能夠積累大量的副淀粉(Paramylon)作為能量貯藏物質(zhì)， 占到裸藻干重的50%—90%[6，7]。副淀粉是一種β-1，3-葡聚糖， 具有增強(qiáng)免疫力[8]、抗過敏[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11，12]活性。在黑暗厭氧條件下， 裸藻細(xì)胞能夠?qū)⒏钡矸鄯纸廪D(zhuǎn)化成蠟酯，而蠟酯具有廣泛的工業(yè)用途， 并可以用來生產(chǎn)生物燃料[13，14]。因此， 纖細(xì)裸藻不但是一種高附加值的保健食品， 也是潛力巨大的生產(chǎn)生物能源的重要原料， 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前， 裸藻的生物學(xué)研究主要集中在細(xì)胞生理、酶學(xué)特征、基因克隆等方面[15—19]， 對(duì)裸藻遺傳轉(zhuǎn)化的研究和應(yīng)用極少， 制約了裸藻遺傳學(xué)和裸藻生物技術(shù)的發(fā)展。文章結(jié)合作者所在課題組的研究工作， 以纖細(xì)裸藻為例， 對(duì)已有的裸藻遺傳轉(zhuǎn)化方法及其存在的問題進(jìn)行了綜述， 并對(duì)未來的研究進(jìn)行了展望。

1 纖細(xì)裸藻的基因組序列及系統(tǒng)生物學(xué)信息

纖細(xì)裸藻含有細(xì)胞核、葉綠體、線粒體3套基因組。裸藻基因組巨大而且具有高度復(fù)雜的序列結(jié)構(gòu)和高比例的重復(fù)序列， 測序拼接的難度極大[20]，經(jīng)過3年多的努力本課題組已經(jīng)率先完成纖細(xì)裸藻野生型藻株Z的基因組草圖， N50 contig已達(dá)150 kb，并已初步確認(rèn)纖細(xì)裸藻基因組約3.3 G， 此結(jié)果經(jīng)過各種方法證實(shí)， 遠(yuǎn)大于模式生物萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的124 M[21]、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的27.4 M[22]、團(tuán)藻(Volvox carteri)的138 M[23]、小球藻(Chlorella variabilis)的46 M[24]； 其含有45%左右的重復(fù)序列， 給二代三代測序相結(jié)合的基因組組裝造成了很大的困難， 該基因組草圖的報(bào)告已經(jīng)投稿； 另外， 通過本課題組獲得的裸藻轉(zhuǎn)錄組和蛋白組， 發(fā)現(xiàn)不同尋常多的非編碼RNA， 完成40128個(gè)基因的鑒定及功能注釋； 其特殊復(fù)雜的間核結(jié)構(gòu)、染色體組型以及基因組3D-STORM掃描、基因組的精細(xì)作圖也正在進(jìn)行。目前英國有實(shí)驗(yàn)室也正在組裝該藻株的基因組， 他們的最新網(wǎng)站公開結(jié)果[EuglenaDB， https://sites.dunde-e.ac.uk/euglenadb/]表明裸藻的基因組大小(1.43 G)， N50為0.9 kb， 此結(jié)果與本課題組測序組裝結(jié)果存在較大差異。每個(gè)裸藻細(xì)胞中含有約10個(gè)葉綠體[25]， 而每個(gè)葉綠體中含有200—600個(gè)基因組拷貝[26]， 葉綠體基因組與原核生物類似， 呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 大小約143 kb， 編碼87個(gè)已知的基因， 在基因內(nèi)部至少含有149個(gè)內(nèi)含子[27]。線粒體基因組為線性結(jié)構(gòu)， 包含多個(gè)5—8 kb的線性片段， 編碼7個(gè)呼吸鏈復(fù)合物蛋白， 包括3個(gè)復(fù)合物Ⅰ亞單位(分別由nad1、nad4、nad5編碼)， 1個(gè)復(fù)合物Ⅲ亞單位(由cob編碼)， 以及3個(gè)復(fù)合物Ⅳ亞單位(分別由cox1、cox2、cox3編碼)； 另外， 線粒體內(nèi)還含有一些小的未知功能的基因片段， 可能與DNA重組和RNA修飾有關(guān)[28]。

裸藻的de novo轉(zhuǎn)錄組在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的初步研究已見報(bào)道[29，30]， 但其他組學(xué)數(shù)據(jù)包括蛋白組、小RNA組和甲基化組尚未見有報(bào)道。本課題組針對(duì)裸藻的葉綠體進(jìn)化及細(xì)胞核-葉綠體的分子通信方面， 在不同的分子層面， 包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組還有甲基化組進(jìn)行了全面的數(shù)據(jù)收集，相關(guān)的文章在整理撰寫當(dāng)中； 與此同時(shí)， 在綠色裸藻里存在著黑暗處理?xiàng)l件下預(yù)光照1.5h可以消除從黑暗到光照下轉(zhuǎn)換過程中長達(dá)12h的葉綠體分化延遲， 本課題組也在通過轉(zhuǎn)錄組試圖探求其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)理； 而鑒于裸藻介于動(dòng)植物的生物特性， 也在研究其microRNA全基因組信息， 及其microRNA在裸藻細(xì)胞光響應(yīng)中的作用； 另外， 本課題組正在利用最新的單細(xì)胞分析技術(shù)， 同時(shí)解析4000—6000多個(gè)纖細(xì)裸藻在黑暗培養(yǎng)條件下添加甲基化酶抑制劑中約15%的細(xì)胞葉綠體分化的多態(tài)性問題?？傊?， 通過各種組學(xué)分析， 本課題組已經(jīng)獲得了一批跟葉綠體分化、葉綠體與細(xì)胞核分子通信相關(guān)的可能性關(guān)鍵基因和非編碼小RNA， 也提出了幾個(gè)新的假說理論， 急需一個(gè)高通量、高效的基因工程技術(shù)方法來進(jìn)行功能驗(yàn)證。

2 纖細(xì)裸藻的抗生素耐受性和篩選標(biāo)記

本課題組對(duì)纖細(xì)裸藻的抗生素耐受性進(jìn)行了詳細(xì)檢測， 發(fā)現(xiàn)10 μg/mL以上的遺傳霉素(G418)和博來霉素(Zeocin)就可以顯著抑制裸藻細(xì)胞的生長，而巴龍霉素、潮霉素、卡那霉素、四環(huán)素以及除草劑(草銨膦)在30 μg/mL時(shí)對(duì)裸藻細(xì)胞仍沒有明顯抑制作用， 用更高濃度(＞ 100 μg/mL)的卡那霉素和巴龍霉素也可以顯著抑制裸藻生長， 說明裸藻對(duì)多數(shù)抗生素和除草劑具有較強(qiáng)的耐受性， 但對(duì)G418和Zeocin較為敏感。

G418是一種氨基糖苷類抗生素， 其結(jié)構(gòu)與巴龍霉素、卡那霉素相似， 通過干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對(duì)細(xì)菌和真核生物細(xì)胞都有毒性。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中， 常用氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)作為篩選標(biāo)記， 該酶催化G418的磷酸化失活， 使細(xì)胞獲得抗性。目前還沒有用G418篩選裸藻的報(bào)道， 但已有文獻(xiàn)使用了巴龍霉素進(jìn)行裸藻突變株篩選， 并用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)作為抗性標(biāo)記[31]。

Zeocin是爭光霉素家族的一種糖蛋白抗生素，能夠降解細(xì)胞內(nèi)的DNA， 對(duì)原核和真核細(xì)胞具有廣泛的抑制作用。在萊茵衣藻的轉(zhuǎn)化中， 采用來源于細(xì)菌Streptoalloteichus hindustanus的ble基因可以賦予藻細(xì)胞對(duì)Zeocin的抗性[32]， 該基因編碼13.5 kD的蛋白， 能夠與Zeocin結(jié)合抑制其活性[33]。在裸藻細(xì)胞內(nèi)， 也有利用ble基因轉(zhuǎn)化和Zeocin篩選的報(bào)道[34]。此外， 文獻(xiàn)還報(bào)道了用aadA基因轉(zhuǎn)化裸藻， 并用鏈霉素和壯觀霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子[35]，aadA基因編碼氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶， 能夠?qū)TP的腺嘌呤基團(tuán)轉(zhuǎn)移到抗生素分子上使其失活。

本實(shí)驗(yàn)室在利用基因槍方法轉(zhuǎn)化含ble和NPTII的線性化質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中， 得到了帶有抗性的裸藻細(xì)胞單克隆， 它們分別能在含80 μg/mL Zeocin和250 μg/mL巴龍霉素的液體CM培養(yǎng)基中生長， 并且也能在同樣抗生素濃度的固體平板上穩(wěn)定生長和傳代， 而野生型裸藻細(xì)胞在此抗生素濃度的培養(yǎng)基中是不能存活并傳代的。

3 外源基因?qū)肼阍寮?xì)胞的方法

除裸藻外， 萊茵衣藻等真核微藻的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)有了較為系統(tǒng)的研究， 建立了多種轉(zhuǎn)化方法，包括基因槍(Biolistic)、電穿孔(Electroporation)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)， 以及玻璃珠研磨法(Glass beads)。

3.1 基因槍法

基因槍是通過高壓氣流將包被了DNA的微粒轟擊進(jìn)入細(xì)胞， 是目前最有效的轉(zhuǎn)化方法之一， 其不受細(xì)胞類型的限制， 在轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用廣泛。該方法已經(jīng)用于萊茵衣藻[36]、三角褐指藻[37]、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)[38]、擬微綠球藻(Nannochloropsis)[39]、團(tuán)藻[40]， 以及裸藻近緣種錐蟲[41]的轉(zhuǎn)化。另外， 基因槍法可以高效地將外源基因?qū)爰?xì)胞器， 例如， Boynton等[42]將野生型衣藻的atpB基因轟擊到3株衣藻葉綠體atpB突變株中， 使其恢復(fù)了光合作用能力； Hu等[43]將抗性基因ble轟擊到衣藻線粒體并穩(wěn)定表達(dá)。

Doetsch等首先將Sanford等建立的基因槍法[44]進(jìn)行改進(jìn)， 并用于纖細(xì)裸藻的轉(zhuǎn)化[35]， 主要步驟為:收集異養(yǎng)條件下生長到對(duì)數(shù)末期的裸藻細(xì)胞， 通過低壓真空抽濾平鋪到濾膜上(直徑45 mm， 孔徑0.22 μm)， 形成細(xì)胞薄層， 將濾膜轉(zhuǎn)移到異養(yǎng)平板上， 2h內(nèi)完成轉(zhuǎn)化。用2.5 μg的質(zhì)粒DNA包被M5型的鎢粉顆粒， 用DuPont PDS-100/He型基因槍和7600 kN/m2的破裂膜， 設(shè)置3.4 kPa的真空度和12.3 cm的靶向距離， 對(duì)裸藻細(xì)胞進(jìn)行一次轟擊后， 將濾膜轉(zhuǎn)移到篩選平板上， 約6周后挑取轉(zhuǎn)化子。

Ogawa等[45]為了提高裸藻轉(zhuǎn)化效率， 對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化的流程做了進(jìn)一步改進(jìn)， 如圖 1所示， 主要步驟為: 離心收集對(duì)數(shù)生長期的纖細(xì)裸藻細(xì)胞， 用無菌水清洗后重懸， 用低壓真空抽濾將細(xì)胞平鋪到濾膜上， 將濾膜放置于CM培養(yǎng)基平板， 黑暗過夜。將0.25 μm的金納米顆粒懸浮于100 μL無菌水， 加入6 μg的DNA， 100 μL 2.5 mol/L CaCl2， 40 μL 0.1 mol/L亞精胺， 4℃混合20min使DNA與金顆粒充分結(jié)合。用Bio-Rad PDS-1000/He型基因槍和900 psi的破裂膜， 設(shè)置9 cm的靶向距離， 對(duì)裸藻細(xì)胞進(jìn)行一次轟擊后， 用2 mL CM培養(yǎng)基洗下藻細(xì)胞， 光照復(fù)蘇過夜后再涂布于篩選平板， 培養(yǎng)直至獲得轉(zhuǎn)化子。

圖 1 基因槍法轉(zhuǎn)化裸藻的流程Fig. 1 The procedure of biolistic transformation of E. gracilis

3.2 電穿孔法

電穿孔是利用高壓電場擊穿細(xì)胞膜， 瞬時(shí)提高膜的通透性， 外源核酸或蛋白分子在電場作用下擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。由于電穿孔技術(shù)操作簡單、成本低，對(duì)細(xì)胞損傷程度小， 是細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)優(yōu)先選擇的轉(zhuǎn)化方法。在微藻研究中， 電穿孔技術(shù)具有比基因槍法更高的轉(zhuǎn)化效率， 但針對(duì)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)化研究較少。萊茵衣藻[46]、小球藻[47]、三角褐指藻[48]、杜氏鹽藻[49]、擬微球藻[50]， 以及衣藻近緣種錐蟲和利什曼原蟲[51]均已經(jīng)建立了穩(wěn)定的電穿孔轉(zhuǎn)化方法。

Krajcovic等[34]報(bào)道了利用電穿孔技術(shù)將ble基因?qū)肼阍寮?xì)胞， 但并未描述電擊的條件。Iseki等參照錐蟲的電穿孔條件， 進(jìn)行改進(jìn)后， 成功將雙鏈RNA(dsRNA)分子導(dǎo)入裸藻細(xì)胞[52，53]， 主要步驟為:收集黑暗培養(yǎng)兩天的裸藻細(xì)胞， 用無機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸， 取90 μL藻液(含有1×106細(xì)胞)轉(zhuǎn)入0.4 cm間隙的電擊杯， 加入RNA溶液混合， 用Bio-Rad Gene Pulser II電轉(zhuǎn)儀， 設(shè)置電擊參數(shù)為1.2 kV和25 μF， 室溫放置30min后再接種到新鮮培養(yǎng)基中。Ishikawa等[54]將電壓降到0.5 kV后仍然能夠?qū)sRNA導(dǎo)入裸藻細(xì)胞， Nakazawa等[55]則將400 μL藻液(含有4×106細(xì)胞)轉(zhuǎn)入0.2 cm間隙的電擊杯， 使用BTX-ECM60型電轉(zhuǎn)儀， 設(shè)置電擊參數(shù)為0.5 kV和200 μF。

Ohmachi等[56]建立了裸藻單細(xì)胞電穿孔技術(shù)，即利用連接注射器的細(xì)口徑微量吸管， 通過負(fù)壓吸附固定單個(gè)裸藻細(xì)胞， 在吸管內(nèi)置入電極和綠色熒光蛋白(GFP)等熒光探針， 施加方波電場成功將熒光探針注入單個(gè)裸藻細(xì)胞， 該方法所用電壓較小為5—20 V， 脈沖時(shí)間為30—500 ms， 頻率為1—5 Hz，持續(xù)時(shí)間為1—5s。

3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

土壤農(nóng)桿菌能夠自然地感染植物細(xì)胞， 并將其Ti質(zhì)粒上的一段T-DNA插入到植物基因組中， 研究人員利用這一原理建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法[57]，并廣泛應(yīng)用于高等植物的基因工程研究。目前， 在萊茵衣藻[58]、小球藻[59]、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[60]、杜氏鹽藻[61]、擬微球藻[62]等微藻中也已經(jīng)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。日本研究者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Zeocin、G418以及潮霉素的抗性基因?qū)肼阍寮?xì)胞， 并在抗性轉(zhuǎn)化子的基因組和轉(zhuǎn)錄組中檢測到了相應(yīng)的抗性基因， 該方法已經(jīng)申請(qǐng)了專利[63]。

3.4 玻璃珠研磨法

Kindle[64]報(bào)道了通過玻璃珠研磨， 將ble基因?qū)爰?xì)胞壁缺陷的萊茵衣藻， 獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率。由于裸藻細(xì)胞沒有細(xì)胞壁， 作者嘗試用玻璃珠研磨法將含有NPTⅡ基因的pRI101-AN質(zhì)粒導(dǎo)入纖細(xì)裸藻， 并用巴龍霉素篩選， 多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)也沒有獲得陽性轉(zhuǎn)化子， 推測原因是裸藻原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌， 難以通過研磨法形成有效穿孔。

4 裸藻的遺傳轉(zhuǎn)化

4.1 細(xì)胞核轉(zhuǎn)化

Krajcovic等[34]首先報(bào)道了裸藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化的方法， 將基因ble克隆到裸藻捕光色素復(fù)合體Ⅱ基因(lhcpII)的5′和3′末端之間， 使其受到lhcpII啟動(dòng)子的調(diào)控表達(dá)， 將該表達(dá)序列通過電穿孔或者基因槍轉(zhuǎn)入裸藻細(xì)胞并在Zeocin平板上篩選， 所得轉(zhuǎn)化子能夠檢測到ble基因， 并且可以穩(wěn)定保存一年以上。

藍(lán)細(xì)菌FBP/SBPase是同時(shí)具有果糖-1，6-二磷酸酶和景天庚糖-1，7-二磷酸酶活性的雙功能酶，Ogawa等將FBP/SBPase與番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(RbcS)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽構(gòu)建成融合蛋白， 用于葉綠體定位， 并將其表達(dá)框架克隆至植物表達(dá)載體pRI101-AN， 受到CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子的調(diào)控， 用基因槍將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入裸藻細(xì)胞，在巴龍霉素平板上得到的陽性轉(zhuǎn)化子中能夠檢測到FBP/SBPase基因序列， 在轉(zhuǎn)化子的葉綠體中也能檢測到FBP/SBPase蛋白， 轉(zhuǎn)化子在高光和高CO2條件下的光合效率， 以及裸藻副淀粉的積累量都顯著提高[31]。作者采用該文獻(xiàn)的方法， 單獨(dú)用pRI101-AN線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化裸藻細(xì)胞， 所得轉(zhuǎn)化子能夠長期保持巴龍霉素抗性， 但在基因組和轉(zhuǎn)錄組中均未檢測到抗性基因NPTII， 分析原因可能是裸藻本身能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗生素耐受性， 因此， 陽性轉(zhuǎn)化子需用多種方法進(jìn)行鑒定。

4.2 葉綠體轉(zhuǎn)化

Doetsch等[35]將aadA基因克隆到光系統(tǒng)II核心蛋白基因psbA的5′和3′末端之間， 使其受到psbA啟動(dòng)子的調(diào)控， 用基因槍將含有該表達(dá)框架的載體導(dǎo)入裸藻葉綠體， 并在含有高濃度鏈霉素和壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。由于鏈霉素和壯觀霉素會(huì)抑制葉綠體蛋白質(zhì)合成， 導(dǎo)致葉綠體發(fā)育受阻和藻細(xì)胞褪色凋亡， 只有導(dǎo)入了aadA基因并有效表達(dá)的轉(zhuǎn)化子才能夠保持綠色生長狀態(tài)。根據(jù)這一表型，Doetsch等[41]獲得了若干陽性轉(zhuǎn)化子， 在其葉綠體中能夠檢測到aadA基因， 但該DNA片段并沒有整合到葉綠體基因組上， 而是以游離元件的形式存在于葉綠體基質(zhì)， 并保持了較低水平的表達(dá)。Doetsch等[41]還將含有葉綠體同源重組片段的載體導(dǎo)入到裸藻細(xì)胞中， 也取得了類似的結(jié)果。此外， 在錐蟲的轉(zhuǎn)化中也發(fā)現(xiàn)了這種外源載體以游離元件形式存在的現(xiàn)象[41]。由于裸藻的遺傳背景尚不清楚， 外源載體在葉綠體內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象還無法解釋。

5 RNA干擾技術(shù)在裸藻細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用研究

RNA干擾(RNAi)是由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象， 這是生物體內(nèi)存在的一種基因表達(dá)的調(diào)控方式。利用這一機(jī)制， 可以人為構(gòu)建目的基因的同源dsRNA， 導(dǎo)入細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)特定基因的表達(dá)抑制。Iseki等[52]首次在裸藻中使用了RNAi技術(shù)來研究核基因的功能， 利用電轉(zhuǎn)化將裸藻藍(lán)光受體―光敏化腺苷酸環(huán)化酶(PAC)的同源dsRNA導(dǎo)入裸藻細(xì)胞， 顯著降低了細(xì)胞內(nèi)PAC的含量， 并且在細(xì)胞分裂幾代之后依然有效。隨后，RNAi技術(shù)在裸藻的基因功能驗(yàn)證中得到廣泛應(yīng)用，表 1展示了到目前為止利用RNAi技術(shù)在裸藻中開展的基因功能研究， 這些基因涉及裸藻的基本代謝、光響應(yīng)、代謝物合成等各個(gè)方面。在這些文獻(xiàn)中用到的導(dǎo)入DNA、基因克隆的方法等加以優(yōu)化后可用于裸藻的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

表 1 利用RNAi技術(shù)的裸藻基因功能研究Tab. 1 RNAi-based study of gene function of Euglena

6 問題與展望

裸藻獨(dú)特的生物學(xué)特征使其具有重要的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 但是無論遺傳學(xué)研究， 還是工業(yè)化應(yīng)用， 都離不開成熟的基因工程手段。國際上只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展了裸藻遺傳轉(zhuǎn)化的研究， 而且正式發(fā)表的文章數(shù)目極少。作者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)裸藻的遺傳轉(zhuǎn)化體系開展了較長時(shí)間的研究， 發(fā)現(xiàn)裸藻的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化存在以下問題: (1)裸藻細(xì)胞在抗生素作用下容易產(chǎn)生較強(qiáng)的耐受性， 導(dǎo)致篩選失?。?(2)外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞后可能以游離形式存在， 不能實(shí)現(xiàn)基因組的插入突變， 而且外源DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制機(jī)理也不清楚。根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)資料的總結(jié)和分析， 作者認(rèn)為裸藻的遺傳轉(zhuǎn)化有以下幾個(gè)研究方向: (1)裸藻基因組測序完成后， 細(xì)胞核內(nèi)外DNA的復(fù)制機(jī)制有待闡明； (2)通過使用高表達(dá)的啟動(dòng)子、密碼子優(yōu)化和內(nèi)含子嵌入等多種方式構(gòu)建更為高效的裸藻篩選標(biāo)記， 以及多種用途的工具載體； (3)建立裸藻線粒體轉(zhuǎn)化體系， 開展線粒體遺傳特征的研究；(4)對(duì)CRISPR/Cas9、Cpf1等基因編輯工具(裸藻中尚未報(bào)道)進(jìn)行優(yōu)化后， 應(yīng)用于裸藻的遺傳改造。今后， 隨著遺傳轉(zhuǎn)化體系的完善， 裸藻的基礎(chǔ)生物學(xué)研究將會(huì)取得較大進(jìn)展， 基因工程改造也將極大地促進(jìn)裸藻的工業(yè)化應(yīng)用和規(guī)模化生產(chǎn)。

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