婁素琳，林 鑫，黃思敏，李 輝,4，胡章立,4

1) 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；2) 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；3) 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點實驗室，廣東深圳 518060；4) 深圳大學(xué)龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，深圳市海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳 518060

雙鏈小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA 或miRNA)結(jié)合蛋白(double-stranded RNA-binding protein, DRB)是一類廣泛存在于真核細胞、細菌和病毒中，含有雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRNA-binding domain，dsRBD)的蛋白．dsRBD 結(jié)構(gòu)域一般由約70個氨基酸殘基組成，具有一定種屬保守性，dsRBD的結(jié)構(gòu)為αβββα折疊[1-4]．DRB在miRNA的生物合成途徑中與核酸酶Dicer協(xié)同作用，共同精確剪切前體而生成成熟miRNA[5-6]．研究表明，DRB在miRNA選擇何種作用方式中也起著重要作用[7-8]．

在動植物中，一般存在多個DRB蛋白成員，且每個DRB在miRNA途徑的分工略有不同[9-11]．?dāng)M南芥DRB蛋白家族共有5個成員DRB1～DRB5，其中， 研究最透徹的是DRB1(即HYPONASTIC LEAVES1，HYL1)．多項研究表明，在擬南芥miRNA 調(diào)控途徑中，DRB1作為DCL1的重要互作因子，可共同作用、精確有效地從初級轉(zhuǎn)錄本剪切生成miRNA，并把其帶至AGO1催化的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC[12-13]，執(zhí)行剪切靶基因mRNA序列或抑制翻譯的作用．?dāng)M南芥DRB1參與miRNA介導(dǎo)的靶mRNA剪切，且是剪切所必需的，然而DRB2是miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制所必需的[14]．此外，DRB2也是DCL1的互作蛋白，DRB2還抑制DRB1的表達．通過對突變體drb1和drb2蛋白組學(xué)的研究，表明DRB1參與的miRNA調(diào)控mRNA剪切，廣泛存在于各個代謝過程，包括合成代謝和分解代謝，尤其脂肪酸降解途徑[14]．反之，DRB2相關(guān)的翻譯抑制顯得不太普遍，只是特異性地響應(yīng)生物或非生物脅迫．

擬南芥DRB1和DRB2均含有兩個dsRBD結(jié)構(gòu)域，DRB1的dsRBD結(jié)構(gòu)域和苔蘚有50%同源性，而DRB2的dsRBD結(jié)構(gòu)域在兩者中有80%同源性，DRB2比DRB1更加保守．文獻[6]研究認為，DRB1和DRB2之所以分工不同，主要是蛋白結(jié)構(gòu)域的差異．DRB1的氨基酸序列和DRB2非常不同，分析drb1的轉(zhuǎn)基因株系揭示了DRB1和DRB2的第1個dsRBD結(jié)構(gòu)域在功能上類似，而第2個dsRBD結(jié)構(gòu)域在功能上明顯不同，生物信息分析表明DRB2的C-末端結(jié)構(gòu)域在miRNA途徑中起功能作用，而DRB1在該位置的結(jié)構(gòu)域是非必須的．

miRNAs調(diào)控途徑在高等多細胞真核生物已得到廣泛深入的研究，但對低等單細胞真核生物的研究非常少[15]．萊茵衣藻是一種重要的單細胞模式微藻，同時也是一種極具經(jīng)濟價值的能源微藻．而miRNAs作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，雖然在萊茵衣藻中的研究起步略晚，但其重要地位不容小覷．所在課題組近年對萊茵衣藻miRNAs的研究取得了一系列成果，不僅在萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)了一些新的miRNAs存在，且還發(fā)現(xiàn)miRNAs在萊茵衣藻缺硫產(chǎn)氫過程中的重要調(diào)控作用[16-17]．目前萊茵衣藻miRNA作用機制的研究非常少，關(guān)于萊茵衣藻CrDRB蛋白在miRNA途徑作用的研究更少．2016年底首次報道了萊茵衣藻的DRB蛋白(DUS16)，證明了DUS16在pri-miRNA的加工過程起著重要作用，發(fā)現(xiàn)DUS16蛋白定位在細胞核和細胞質(zhì)，且與CrDCL3相互作用[18-19]．本研究擬挖掘萊茵衣藻所有DRB蛋白，并對其進行生物信息學(xué)分析，為下一步全面揭示萊茵衣藻CrDRB的功能，及其在miRNA調(diào)控途徑的不同分工奠定基礎(chǔ)．

1 實驗方法

1.1 萊茵衣藻藻株及培養(yǎng)條件

萊茵衣藻藻株 cc849 購自萊茵衣藻資源中心(https://www.chlamycollection.org/)．衣藻在TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集藻細胞用于總RNA的提?。?/p>

1.2 總RNA的提取

① 收集藻體后用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中(粉末不超過管身一半)，加入1 mL Trizol抽提液，充分搖勻，漩渦振蕩10 min；② 加200 μL氯仿，混勻5 min，室溫放置15 min，于10 ℃以下，12 000 r/min離心15 min；③ 吸取上清于另一滅菌的離心管中(上清約600 μL)，加入400 μL預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃沉淀1～2 h，或于-70 ℃沉淀10 min，然后12 000 r/min離心10 min；④ 倒掉上清，保留沉淀，加入1 mL體積分數(shù)為75%乙醇(焦碳酸二乙酯，diethyl pyrocarbonate，DEPC)，輕彈使沉淀懸起，7 500 r/min離心5 min，倒掉上清，再重復(fù)1次；⑤ 室溫風(fēng)干RNA，加入20～30 μL DEPC處理水溶解，-70 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 cDNA的獲得

反轉(zhuǎn)錄具體步驟參照Promega M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，略有改動．① 取5 μL RNA，加5 μL 濃度為10 μmol/L的引物Oligo (dT)20，混勻，70 ℃反應(yīng)5 min，打開RNA的二級結(jié)構(gòu)，立即置于冰上5 min；② 往上述反應(yīng)液加入5 μL 5×M-MLV緩沖液、1.25 μL濃度為10 mmol/L的dNTP 混合物、1 μL M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和7.5 μL DEPC處理水，混勻，25 ℃反應(yīng)5 min，然后42 ℃反應(yīng)1 h，最后置于70 ℃孵育10 min使酶失活；③ cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存．所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接作為聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的模板．

1.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)是應(yīng)用SYBR Premix Ex TagTMⅡ試劑盒(Takara)的反應(yīng)體系，按說明書操作．PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s (取決于不同引物的Tm值)，72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)．在65～95 ℃，每0.5 s讀取熒光強度分析熔解曲線．每個樣品重復(fù)3次．實時熒光定量PCR檢測的數(shù)據(jù)采用相對定量的二階導(dǎo)數(shù)法分析(2-△△Ct)．

△△Ct=Ctsample-Ctactin

(1)

其中，Ctsample和Ctactin分別是目的基因和內(nèi)參基因actin的Ct值，Ct為熒光閾值．

1.5 進化樹構(gòu)建

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載萊茵衣藻和擬南芥的所有 DRB 基因序列，在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫預(yù)測DRB的dsRBD結(jié)構(gòu)域，并獲取其序列，使用 MUSCLE軟件對所有 dsRBD 序列進行對位排列，利用 MEGA7.0 軟件構(gòu)建鄰接法(neighbor joining)系統(tǒng)進化樹．

2 結(jié)果與分析

2.1 萊茵衣藻CrDRB的dsRBD結(jié)構(gòu)域位置

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載萊茵衣藻的全基因組序列，從蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域 Pfam 數(shù)據(jù)庫中下載DRB基因的結(jié)構(gòu)域模塊PFAM00035，使用 HMMER 軟件基于 DRB 結(jié)構(gòu)域檢索萊茵衣藻全基因組，獲得萊茵衣藻中所有含 dsRBD 結(jié)構(gòu)域的 DRB 蛋白共4個，其中，1個為已經(jīng)報道的DUS16(Cre05.g232004.t1.1)[18-19]．將另外3個DRB蛋白分別命名為CrDRB1(Cre06.g280500.t1.1)、CrDRB2(Cre13.g574650.t1.1)和CrDRB3 (Cre03.g199550.t1.2)． 萊茵衣藻的4個DRB蛋白大小為518～2 037個氨基酸殘基不等，dsRBD結(jié)構(gòu)域在蛋白的位置如圖1．

圖1 萊茵衣藻CrDRB蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域位置Fig.1 The location of dsRBD domain of Chlamydomonas CrDRB

2.2 萊茵衣藻CrDRB基因的克隆

根據(jù)Phytozome 數(shù)據(jù)庫中萊茵衣藻4個CrDRBs基因的cDNA編碼區(qū)序列，設(shè)計引物，PCR分別擴增4個基因，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2，條帶大小均符合預(yù)期，即DUS16為1 557堿基對(base pair，bp)，CrDRB1為6 042 bp，CrDRB2為2 355 bp，CrDRB3為4 251 bp．

圖2 PCR檢測萊茵衣藻4個CrDRBs基因Fig.2 PCR detection of four CrDRBs genes in Chlamydomonas

2.3 萊茵衣藻CrDRB基因的表達分析

為分析比較萊茵衣藻中4個CrDRBs基因的mRNA表達水平．收集對數(shù)生長期的衣藻細胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA．每個CrDRBs基因設(shè)計3～4對qRT-PCR引物，測試之后選取一對溶解曲線最佳，特異性最好的引物做后續(xù)基因表達分析．以actin基因為內(nèi)參基因，DUS16與actin的表達量比值設(shè)為1，其他幾個基因的相對表達量分別如圖3所示．由圖3可見，基因CrDRB3和CrDRB1的相對表達水平顯著高于已報道的DUS16[18]， 而CrDRB2的相對表達水平則顯著低于DUS16．

圖3 qRT-PCR分析萊茵衣藻4個CrDRBs基因的相對表達水平Fig.3 qRT-PCR analysis of the relative expression of four CrDRBs in Chlamydomonas

2.4 萊茵衣藻CrDRBs蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI的Protein Blast及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析，獲取萊茵衣藻4個CrDRBs蛋白的dsRBD序列，分別將該4段序列通過軟件Phyre2在線預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，方法參考文獻[20]．萊茵衣藻4個CrDRBs蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域如圖4，CrDRB1、CrDRB3和DUS16蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域均可形成αβββα的拓撲結(jié)構(gòu)，這是DRB蛋白特有的結(jié)構(gòu)．但是CrDRB2蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域中β折疊不明顯．

圖4 萊茵衣藻4個CrDRBs蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域Fig.4 dsRBD domain of four CrDRBs in Chlamydomonas

2.5 同源比對分析萊茵衣藻各個CrDRBs基因序列

將萊茵衣藻4個CrDRBs的dsRBD序列，通過BioEdit軟件的ClustalW multiple alignment多列比對分析(圖5)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個dsRBD序列有一定的同源性，其中有3個保守的氨基酸，分別是1個亮氨酸L和2個甘氨酸G，均處于N端．

2.6 萊茵衣藻和擬南芥dsRBD的進化分析

擬南芥中5個DRBs蛋白在miRNA途徑的作用有明確分工，為探究萊茵衣藻中4個CrDRBs在miRNA途徑可能的功能，及其與擬南芥的異同．將萊茵衣藻CrDRBs的dsRBD結(jié)構(gòu)域與擬南芥5個DRBs成員的10個dsRBD結(jié)構(gòu)域(每個擬南芥DRB均有兩個dsRBDs)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖6)．從進化樹的結(jié)果看出，大致分為了萊茵衣藻CrDRBs與擬南芥DRBs兩大簇，其中，萊茵衣藻CrDRB2與DUS16在進化上較相近，而CrDRB3與其他衣藻CrDRBs較遠．

圖5 萊茵衣藻CrDRBs蛋白dsRBD結(jié)構(gòu)域同源性比較Fig.5 Sequence alignment of dsRBD domain of CrDRBs in Chlamydomonas

圖6 萊茵衣藻與擬南芥dsRBD結(jié)構(gòu)域的進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of dsRBD domain in Chlamydomonas and Arabidopsis

3 討 論

DRB是一類含有dsRBD的蛋白，除參與RNA的加工和翻譯調(diào)控外，另一重要功能是，在miRNA的生物合成和作用方式選擇方面起著重要作用[21]．一般情況，擬南芥或其他高等植物的DRB蛋白大多具有兩個或以上的dsRBD結(jié)構(gòu)域，但從圖1結(jié)果看出，萊茵衣藻的4個CrDRBs蛋白均只有1個dsRBD結(jié)構(gòu)域．造成這種差異的原因可能是萊茵衣藻屬于低等生物，在由低等生物到高等植物的進化過程中，dsRBD由1個拷貝演變到多個拷貝．同源比對分析萊茵衣藻4個CrDRBs蛋白的dsRBD結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)相似性不是特別高，有3個氨基酸是保守的．然而，擬南芥DRB成員的dsRBD同源性高達90%．究其原因可能是dsRBD結(jié)構(gòu)域在不同物種之間，尤其是在高等植物和低等微藻之間的差異較大．此外，發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻CrDRB2的dsRBD結(jié)構(gòu)域不具有典型的完整αβββα拓撲結(jié)構(gòu)，對此下一步將通過RNA結(jié)合實驗來確定CrDRB2是否為雙鏈RNA結(jié)合蛋白．

從文獻[9]可知擬南芥的5個DRB蛋白均小于500個氨基酸，最大的DRB2為434個氨基酸．但從圖1和2可見，萊茵衣藻的CrDRB蛋白普遍較大，CrDRB1為2 037個氨基酸，CrDRB3為1 416個氨基酸，最小的DUS16為518個氨基酸．萊茵衣藻CrDRBs不僅蛋白較大，且GC含量也較高，導(dǎo)致基因的克隆和蛋白的表達難度也增加了．?dāng)M南芥5個DRB蛋白的功能已經(jīng)很明確，其在miRNA途徑的分工也很清晰．但在萊茵衣藻中，目前只有DUS16有相關(guān)報道，DUS16與CrDCL3相互作用，共同參與pri-miRNA的剪切．萊茵衣藻其他3個CrDRBs是否也參與了miRNA途徑，目前尚不清楚，它們是否參與決定miRNA剪切或抑制翻譯的調(diào)控方式也尚待進一步研究．

利用qRT-PCR分析萊茵衣藻CrDRBs的基因表達水平，CrDRB3的相對表達量最高，是DUS16的2倍多；CrDRB1的表達水平也較高，約為DUS16的1.5倍；CrDRB2的相對表達量最低．由此說明在萊茵衣藻對數(shù)生長時期，CrDRB3 和CrDRB1基因相對較活躍，可能參與了多個生物學(xué)過程．

綜上可見，DRB是一類雙鏈RNA結(jié)合蛋白，在miRNA調(diào)控過程起著重要作用．本研究獲得萊茵衣藻中4個含 dsRBD 結(jié)構(gòu)域的 CrDRBs 蛋白相關(guān)信息，其中包括已經(jīng)報道的RNA結(jié)合蛋白DUS16．分析4個CrDRBs基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)CrDRB3和CrDRB1的相對表達較高．預(yù)測4個CrDRBs的dsRBD二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)除CrDRB2之外，其他3個CrDRBs蛋白均可形成DRB蛋白特有的αβββα拓撲結(jié)構(gòu)．將萊茵衣藻CrDRBs的dsRBD與擬南芥的5個DRB成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析，初步探討分析萊茵衣藻CrDRBs各成員的的進化保守性．為下一步全面揭示萊茵衣藻CrDRB蛋白功能，及其在miRNA調(diào)控途徑的具體分工奠定了基礎(chǔ)．