邱振魯 彭志蕓 陳鈺涵 李新顏 顏菲菲 曲奕　鐘曉璇

摘要 [目的]研究低濃度磷酸鹽對(duì)銅綠微囊藻和衣藻生長的影響。[方法]以BG-11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制成不同磷酸鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基，使用葉綠素a含量與培養(yǎng)液吸光度作為指標(biāo)檢測(cè)銅綠微囊藻和衣藻的生長狀況。[結(jié)果]磷酸鹽是銅綠微囊藻生長的限制性因素，其濃度為0.02～0.10 mg/L時(shí)，隨磷酸鹽濃度增加，銅綠微囊藻生長速率增高，在磷酸鹽質(zhì)量濃度為0.10 mg/L時(shí)，生長情況最好；當(dāng)濃度達(dá)到0.20 mg/L時(shí)，生長速率不再增高。而對(duì)于衣藻，磷酸鹽質(zhì)量濃度0.01～0.15 mg/L可以促進(jìn)衣藻的增殖，在質(zhì)量濃度為0.10 mg/L時(shí)，其生長最好；而濃度達(dá)到0.20 mg/L時(shí)，衣藻的生長出現(xiàn)了輕微的抑制現(xiàn)象。[結(jié)論]該研究可為繡源河風(fēng)景區(qū)水體富營養(yǎng)化的評(píng)價(jià)和預(yù)防提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞 磷酸鹽；銅綠微囊藻；衣藻；葉綠素a；吸光度；繡源河

中圖分類號(hào) S181 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）18-0054-03

Effect of Low Concentration of Phosphate on the Growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii in Xiuyuan River

QIU Zhenlu1，PENG Zhiyun2，CHEN Yuhan1 et al （1.College of Chemical and Biological Engineering，Qilu Institute of Technology，Jinan，Shandong 250200；2.College of Biological Science，Sichuan Agriculture University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]The research aimed to study the effect on the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii under low concentrations of phosphate.[Method] The two alga were cultured in BG11 medium containing different concentrations of phosphate.And this article adopted the content of Chlorophyll a and absorbance of culture medium to indicate the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii.[Result] Phosphate was the limiting factor for the growth of Microcystis aeruginosa.The growth rate of Microcystis aeruginosa increased with the concentration of phosphate increased from 0.02 mg/L to 0.10 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Microcystis aeruginosa was proved to be 0.10 mg/L.But for Chlamydomonas reinhardtii，the growth was proliferated under the phosphate concentration ranged from 0.01 mg/L to 0.15 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Chlamydomonas reinhardtii was proved to be 0.10 mg/L.The growth status was inhibited when the concentration reached 0.20 mg/L.[Conclusion]The study provides a reliable data reference for the evaluation and prevention of eutrophication in Xiuyuan River.

Key words Phosphate；Microcystis aeruginosa；Chlamydomonas reinhardtii；Chlorophyll a；Absorbance；Xiuyuan River

氮磷過多是造成水體富營養(yǎng)化的主要因素。銅綠微囊藻是藍(lán)藻水華中重要的藻類，氮和磷是影響其增殖的重要因素。研究表明，銅綠微囊藻對(duì)磷的濃度響應(yīng)更為敏感[1-3]。關(guān)于磷對(duì)銅綠微囊藻生長的影響已見報(bào)道[4-6]。另有研究表明，銅綠微囊藻在磷營養(yǎng)缺乏的情況下仍能以較高生長速率維持生長數(shù)天左右，對(duì)水華形成具有重要的作用[7]。衣藻雖然不是水體富營養(yǎng)化的主要藻類，但也有相關(guān)衣藻水華的報(bào)道，如徐敏等[8]研究了武漢公園小池塘的衣藻水華消長的環(huán)境影響因素；朱詠莉等[9]對(duì)衣藻水華多次發(fā)生的原因進(jìn)行了分析，其認(rèn)為衣藻水華加速了水-泥界面磷素的釋放，造成部分沉降至底泥表面的藻體增殖和再懸浮。所以，在關(guān)注富營養(yǎng)化問題時(shí)也不能忽略衣藻的因素。對(duì)于小清河章丘段風(fēng)景化改造的繡源河風(fēng)景區(qū)水體，卻鮮見相關(guān)研究銅綠微囊藻和衣藻生長條件的報(bào)道。筆者對(duì)章丘繡源河風(fēng)景區(qū)水體中分離得到的銅綠微囊藻和衣藻分別進(jìn)行磷酸鹽生長影響的探索，在實(shí)驗(yàn)室配置不同磷濃度的培養(yǎng)基，使用葉綠素a含量與培養(yǎng)液吸光度2個(gè)指標(biāo)判定2種藻類的生長情況，并與其他水體中相同藻類的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，以期為繡源河風(fēng)景區(qū)水體富營養(yǎng)化程度的判定、預(yù)防和防治提供可靠的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器 722型分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）、SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌鍋（山東鄄城光明儀器有限公司）、光照培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）、80-2型低速離心機(jī)（江蘇省金壇市正基儀器有限公司）、JY1002型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

每1 L培養(yǎng)基中含NaNO3 1.5 g、KNO3 0.04 g、Na2HPO4 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·2H2O 0.036 g、C6H8O7 0.006 g、FeCl3·6H2O 0.006 g、EDTA-Na2 0.001 g、Na2CO3 0.002 g，微量元素A5 1 mL。

A5微量元素配方：每1 L中含有H3BO3 2.86 g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、NaMoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g。

1.3 磷酸鹽濃度梯度的配制 向培養(yǎng)基內(nèi)加入Na2HPO4，使其最終濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L的濃度梯度培養(yǎng)基。

1.4 銅綠微囊藻和衣藻的分離培養(yǎng)

按照《全國湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》的要求對(duì)繡源河進(jìn)行采樣，回實(shí)驗(yàn)室后將水樣進(jìn)行梯度稀釋并接種在提前配制好的24 h培養(yǎng)無雜菌、雜藻污染的BG-11培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱中，25 ℃，光暗比12 h∶12 h進(jìn)行培養(yǎng)，至長出完整的藻落，將藻落在顯微鏡下進(jìn)行觀察，選出銅綠微囊藻和衣藻，用毛細(xì)管吸取單細(xì)胞藻體分別接種在新的BG-11培養(yǎng)基中以獲得純種培養(yǎng)。

1.5 藻細(xì)胞的磷酸鹽饑餓培養(yǎng)及磷酸鹽生長影響試驗(yàn)

將分離純化好的藻種接入BG-11液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液經(jīng)過3 d饑餓處理，取20 mL藻液，4 000 r/min，離心10 min，離心后倒掉上清液，加入等體積的NaHCO3溶液（15 mg/L），充分振蕩搖勻后，再次離心倒去上清液，反復(fù)數(shù)次后，向沉淀中加入等量超純水，搖勻備用[10]。將處理后的藻液接入配制好的不同磷酸鹽質(zhì)量濃度（0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）的BG-11培養(yǎng)基中，接種量為20 mL。接種完畢，均在自然環(huán)境中培養(yǎng)，保證受光充分。pH不得高于8.5。經(jīng)測(cè)定，培養(yǎng)液中的pH為8.0，符合培養(yǎng)條件。

1.6 藻體生長指標(biāo)的測(cè)定

使用葉綠素a含量和培養(yǎng)液吸光度2個(gè)指標(biāo)判定藻體生長狀況，從接種開始，每隔48 h測(cè)定一次這2個(gè)指標(biāo)。吸光度的測(cè)定使用722型分光光度計(jì)，銅綠微囊藻測(cè)定在450 nm波長下，衣藻測(cè)定在470 nm波長下[10]進(jìn)行。葉綠素a的測(cè)定使用甲醇萃取后在665 nm測(cè)定吸光度，依據(jù)公式

C=吸光度×13.9[11]計(jì)算葉綠素的含量（C）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷酸鹽濃度對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

2.1.1 磷酸鹽濃度對(duì)葉綠素a含量的影響。

從圖1可看出，在不同磷酸鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)的藻液葉綠素a含量明顯不同，但變化周期和規(guī)律相對(duì)一致，增加速率最快發(fā)生在培養(yǎng)的第4～8天。磷酸鹽濃度0.01～0.15 mg/L的葉綠素a含量均比對(duì)照組高，且在0.02～0.10 mg/L隨磷酸鹽濃度增加，藻體內(nèi)葉綠素a含量增大，說明此范圍內(nèi)銅綠微囊藻葉綠素a的合成積累量與磷酸鹽濃度增加呈正相關(guān)，即此范圍內(nèi)的磷酸鹽質(zhì)量濃度顯著促進(jìn)銅綠微囊藻的葉綠素a合成與生長繁殖，尤其在0.10 mg/L的濃度下，葉綠素a的增長最快，含量最高，說明此濃度是該培養(yǎng)條件下銅綠微囊藻生長的最適磷酸鹽質(zhì)量濃度。當(dāng)磷酸鹽濃度為0.15和0.20 mg/L時(shí)，葉綠素a含量與對(duì)照組差異不大，可認(rèn)為此濃度的磷酸鹽對(duì)銅綠微囊藻的生長無明顯作用。

2.1.2 磷酸鹽濃度對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞吸光度的影響。

從圖2可看出，在不同磷酸鹽濃度下培養(yǎng)的藻液吸光度差異明顯，但變化規(guī)律與葉綠素a含量一樣，也呈現(xiàn)一致性。磷酸鹽濃度在0.01～0.15 mg/L時(shí)試驗(yàn)組吸光度均高于對(duì)照組，且在0.02～0.10 mg/L時(shí)試驗(yàn)組的吸光度明顯高于對(duì)照組，并隨磷酸鹽濃度增加，培養(yǎng)液吸光度增加，說明此范圍內(nèi)銅綠微囊藻的生長與磷酸鹽濃度呈現(xiàn)正相關(guān)；另外，在磷酸鹽濃度為0.10 mg/L時(shí)，藻液的吸光度達(dá)到了增加最快，值也達(dá)到最大，說明此濃度是銅綠微囊藻的最適磷酸鹽濃度。磷酸鹽濃度為0.15和0.20 mg/L時(shí)，吸光度增加不明顯，與對(duì)照組差異不大，可認(rèn)為0.15～0.20 mg/L磷酸鹽濃度對(duì)銅綠微囊藻的生長無影響。該指標(biāo)所得數(shù)據(jù)與上述葉綠素a含量數(shù)據(jù)呈現(xiàn)一致性。

2.2 不同磷酸鹽濃度對(duì)衣藻生長的影響

2.2.1 磷酸鹽濃度對(duì)葉綠素a含量的影響。

從圖3可看出，不同磷酸鹽濃度下衣藻葉綠素a含量的變化從第6天才開始體現(xiàn)出來。磷酸鹽濃度在0～0.15 mg/L時(shí)，葉綠素a含量均比對(duì)照組高，表明此濃度范圍內(nèi)均可以促進(jìn)衣藻的生長繁殖。磷酸鹽濃度0.01～0.10 mg/L是與衣藻葉綠素a合成量呈正相關(guān)的濃度范圍，且在磷酸鹽濃度為0.10 mg/L時(shí)，葉綠素a的含量達(dá)到了最高。磷酸鹽濃度在0.20 mg/L時(shí)葉綠素a的含量比對(duì)照組有所降低，說明磷酸鹽濃度在0.20 mg/L時(shí)會(huì)抑制衣藻的葉綠素a合成。

2.2.2 磷酸鹽濃度對(duì)衣藻細(xì)胞吸光度的影響。

從圖4可看出，磷酸鹽濃度的差異對(duì)衣藻培養(yǎng)液的吸光度影響不如其對(duì)銅綠微囊藻明顯，并且在培養(yǎng)第8天后效果才逐漸顯現(xiàn)，磷酸鹽濃度在0～0.20 mg/L時(shí)吸光度較對(duì)照組均有所增加，且在磷酸鹽濃度為0.01～0.10 mg/L時(shí)，衣藻的吸光度增加最為明顯，說明此濃度范圍是衣藻生長的最適磷酸鹽濃度范圍。與葉綠素a指標(biāo)比較，并沒有出現(xiàn)0.20 mg/L吸光度低于對(duì)照組的現(xiàn)象，可能是由于在此濃度下藻體細(xì)胞死亡仍然有吸光度但是不再合成葉綠素的原因，故認(rèn)為0.20 mg/L磷酸鹽濃度也抑制了衣藻的生長。

3 討論與結(jié)論

該研究中磷酸鹽對(duì)銅綠微囊藻生長的影響與李夜光等[12]的研究數(shù)據(jù)基本一致，而與張勝花等[13]、張芹等[14]的研究差異較大，這可能是因?yàn)槔C源河風(fēng)景區(qū)水體中氮磷濃度一直較低，銅綠微囊藻吸收磷酸鹽的能力不強(qiáng)，利用磷酸鹽進(jìn)行代謝的酶活性不高，所以試驗(yàn)中所測(cè)得的最適磷濃度低于其他研究。銅綠微囊藻對(duì)于磷有較強(qiáng)的儲(chǔ)存能力，對(duì)營養(yǎng)鹽的結(jié)合也比其他藻類強(qiáng)，可以更有效地利用營養(yǎng)物質(zhì)[14-15]，故后續(xù)試驗(yàn)中還要進(jìn)一步延長試驗(yàn)周期，以檢測(cè)對(duì)蓄積磷的利用效果。另外，試驗(yàn)中使用了靜置培養(yǎng)的方式，與其他研究中采用的搖床培養(yǎng)相比，不利于藻細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)之間的充分混合，也可能是限制銅綠微囊藻利用磷酸鹽的因素。造成差異的具體機(jī)制后續(xù)會(huì)通過磷酸鹽蓄積試驗(yàn)進(jìn)行探究。

對(duì)于衣藻生長條件的研究所見報(bào)道較少，僅見李夜光等[12]的報(bào)道，與之相比該研究所測(cè)得的衣藻最適生長磷濃度相對(duì)較低的原因筆者認(rèn)為可以同上述銅綠微囊藻的分析。

從繡源河風(fēng)景區(qū)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)來看，該區(qū)域水體并未達(dá)到富營養(yǎng)化的程度，但是由于其周邊不斷城鎮(zhèn)化的發(fā)展，由于山東大學(xué)即將遷址繡源河周邊，將來難免有更多的生活、試驗(yàn)廢水排入繡源河水體，如果不加以嚴(yán)格控制，則水體的富營養(yǎng)化程度肯定會(huì)加強(qiáng)。所以對(duì)繡源河風(fēng)景區(qū)水域進(jìn)行富營養(yǎng)化的判定、預(yù)防和防治，目前都需要可靠的數(shù)據(jù)支持與相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步。

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