王 茜 郭鵠飛 王 蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 太原 030006)

鎘作為一種強(qiáng)致癌物質(zhì)， 對(duì)水生生物的影響越來(lái)越受到人們的高度重視[1]。研究發(fā)現(xiàn)， 鎘的半衰期長(zhǎng)， 能夠在動(dòng)物體內(nèi)蓄積并產(chǎn)生毒性， 對(duì)機(jī)體造成氧化損傷， 產(chǎn)生大量的自由基， 同時(shí)也增加細(xì)胞膜的通透性， 為其他重金屬進(jìn)入細(xì)胞提供便利[2，3]。鎘會(huì)影響水生動(dòng)物的攝食能力， 造成攝食率的降低或停止。例如， 側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)在較低濃度的重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)脅迫下， 周期性活動(dòng)或攝食的行為都產(chǎn)生異常， 在較高的濃度下使得珊瑚無(wú)法適應(yīng)并導(dǎo)致死亡[4]； 水螅(Hydra peseudoligactis)攝食率在受到重金屬離子(Cu2+、Cr6+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)脅迫時(shí)也會(huì)受到抑制[5，6]； 安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus Annandalei)在急性以及慢性重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)中毒后， 攝食率會(huì)受到一定程度影響， 且雄性成體的攝食率普遍低于雌性成體的[7]。水生動(dòng)物的攝食能力受到抑制將導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)物攝取量的減少，并對(duì)其生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生干擾。因此， 攝食能力是獲得一切生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量的基礎(chǔ)。同時(shí)， 也是水生動(dòng)物毒性應(yīng)激反應(yīng)在生態(tài)上重要而敏感的指標(biāo)。

在水生生態(tài)環(huán)境中， 大型溞(Daphnia magna)作為國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物， 已被廣泛用于生態(tài)毒理學(xué)和水生生態(tài)學(xué)的研究[8]。大型溞在淡水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中占優(yōu)越性地位， 且生殖周期短、繁殖迅速、對(duì)水體中有害污染物質(zhì)敏感等特點(diǎn)也使其在水環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)中得到普遍應(yīng)用[9，10]。

鑒于此， 本實(shí)驗(yàn)研究了鎘脅迫下大型溞的攝食率、濾水率、鎘的蓄積量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性。初步探討了鎘對(duì)大型溞攝食能力的影響及機(jī)制， 旨在為溞類攝食的深入研究、為水質(zhì)監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)中所用到的大型溞已經(jīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)了2年以上， 其敏感度達(dá)到中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)、物質(zhì)對(duì)溞類(大型溞)急性毒性測(cè)定方法》(GB/T13266-91)[11]的要求， 培養(yǎng)大型溞的水溫(20±1)℃、pH 7.2、溶氧量7 mg/L、光照周期光∶暗=16h∶8h； 普通小球藻(Chlorella vulgaris)藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)。

1.2 主要試劑

氯化鎘(CdCl2.2.5H2O， 分析純)購(gòu)自天津市博迪化工有限公司， 實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水配成1000 mg/L母液； 標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液(1000 mg/L)由環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所提供； 硝酸(優(yōu)級(jí)純， 北京化工廠)； 30%過(guò)氧化氫(分析純， 天津市天力化學(xué)試劑有限公司)； 乙酰膽堿酯酶(AChE)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所； 蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)[12]， Ⅴ類水質(zhì)的鎘濃度標(biāo)準(zhǔn)限值的1倍、5倍、9倍， 設(shè)置了3個(gè)鎘濃度組(0.01、0.05和0.09 mg/L)、1個(gè)空白對(duì)照和2個(gè)處理時(shí)間(24h和48h)。除攝食率和濾水率的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中大型溞喂食外， 其他實(shí)驗(yàn)處理期間不喂食。

攝食率與濾水率的測(cè)定在實(shí)驗(yàn)前選取大小一致、含卵的大型溞100只放入2 L的燒杯中培養(yǎng)， 18h后取走母溞， 24h時(shí)選擇個(gè)體大小基本一致的120只一日齡幼溞(＜24h)， 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組添加相同數(shù)量的小球藻和10只幼溞， 同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(加入相同數(shù)量的小球藻但不加幼溞)。小球藻的初始密度為5×105cells/mL， 在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 溫度(20±1)℃。參照光密度法測(cè)定鎘染毒24h、48h后小球藻的密度。依據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算濾水率(F)和攝食率(I)[13]。

大型溞體內(nèi)鎘含量的測(cè)定參照火焰原子吸收法[14]測(cè)定大型溞體內(nèi)的鎘含量。

T-AOC、MDA含量和AChE活性的測(cè)定分別在染毒24h、48h取樣。按生物量0.1 g/400 μL加入預(yù)冷的生理鹽水， 在冰浴條件下用電動(dòng)勻漿器制備勻漿液， 4℃、12000 r/min離心30min， 取上清液作為酶源。按照試劑盒提供的步驟對(duì)T-AOC、MDA含量、AChE活性和蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)， 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示， *P＜0.05表示顯著性差異，**P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 鎘對(duì)大型溞攝食率與濾水率的影響

如圖 1所示， 大型溞的攝食率(圖 1A)和濾水率(圖 1B)隨著鎘濃度的升高均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。鎘處理24h， 濃度為0.09 mg/L時(shí)， 大型溞濾水率和攝食率與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)； 而濃度為0.01 mg/L、0.05 mg/L時(shí)， 濾水率和攝食率無(wú)顯著性差異。鎘處理48h， 與對(duì)照組相比， 各濃度組濾水率均極顯著降低(P＜0.01)； 攝食率也呈現(xiàn)顯著性或極顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)， 且鎘濃度為0.09 mg/L時(shí)，攝食率比對(duì)照組降低了43.89%。

圖 1 鎘對(duì)大型溞攝食率(A)和濾水率(B)的影響Fig. 1 Effect of cadmium on the ingestion rate (A) and filtration rate (B) in Daphnia magna

2.2 鎘在大型溞體內(nèi)的積累

由圖 2可知， 鎘在大型溞體內(nèi)的蓄積量隨著濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比， 鎘處理24h、48h， 濃度0.05 mg/L時(shí)的蓄積量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)； 濃度0.09 mg/L時(shí)的蓄積量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)； 濃度0.01 mg/L時(shí)沒(méi)有顯著性。通過(guò)相關(guān)性分析， 鎘的蓄積量與濃度之間存在較高的相關(guān)性(R2=0.9903)(圖 3)。

圖 2 鎘在大型溞體內(nèi)的積累Fig. 2 Bioaccumulation of cadmium in Daphnia magna

圖 3 鎘在大型溞體內(nèi)的積累量與鎘濃度的相關(guān)性Fig. 3 The correlation between the accumulation of cadmium inDaphnia magna and its concentrations

2.3 鎘對(duì)大型溞總抗氧化能力(T-AOC)和脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA)的影響

由圖 4可見(jiàn)， 大型溞T-AOC隨鎘濃度的升高而增加， 具有濃度—效應(yīng)關(guān)系。鎘處理24h、48h， 濃度0.09 mg/L時(shí)， T-AOC與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而且在鎘處理后， T-AOC與攝食率之間呈負(fù)相關(guān)性， 相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9521、0.9389 (表1)。

由圖 5可知， 大型溞體內(nèi)MDA含量隨鎘濃度的升高表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。處理24h， 濃度0.05 mg/L時(shí)，MDA含量較對(duì)照組有極顯著差異(P＜0.01)。處理24h、48h， 濃度0.09 mg/L時(shí)， 與對(duì)照組相比MDA含量有顯著差異(P＜0.05)。

2.4 鎘對(duì)大型溞乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響

由圖 6可看出， 大型溞體內(nèi)AChE活性隨著鎘濃度的升高而降低。與對(duì)照組相比， 鎘處理24h、48h，濃度0.01 mg/L時(shí)， 酶活力與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 濃度0.05 mg/L、0.09 mg/L時(shí)， 酶活力顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 鎘的積累對(duì)大型溞攝食能力的影響

鎘在大型溞體內(nèi)的積累量具有濃度—時(shí)間效應(yīng)， 尤其在濃度0.09 mg/L時(shí)， 大型溞體內(nèi)的蓄積量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。水體中的鎘以帶正電的Cd2+形式存在， 可經(jīng)過(guò)體表直接進(jìn)入大型溞體內(nèi)[15]；另外， 也可吸附于小球藻通過(guò)攝食進(jìn)入機(jī)體[16]。通過(guò)以上2種途徑進(jìn)入機(jī)體的鎘一部分會(huì)被自身代謝，但大部分蓄積在體內(nèi)， 從而對(duì)大型溞正常的生理功能產(chǎn)生影響。此外， 大型溞食用未被污染的藻類，腸道需要15—30min可以完全凈化， 而食用被鎘污染后的藻類后， 需要3—6h才能完全凈化干凈[17]， 表明鎘污染后造成了大型溞腸道蠕動(dòng)能力降低， 延長(zhǎng)食物在腸道的停留時(shí)間。

圖 4 鎘對(duì)大型溞總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig. 4 Effect of cadmium on total antioxidant capacity (T-AOC)of Daphnia magna

表 1 鎘脅迫下大型溞不同測(cè)定參數(shù)與攝食率的相關(guān)性分析Tab. 1 The correlation of feeding rate and different assays performed with D. magna for cadmium

圖 5 鎘對(duì)大型溞丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effect of cadmium on malondialdehyde (MDA) content in Daphnia magna

圖 6 鎘對(duì)大型溞乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響Fig. 6 Effect of cadmium on the activities of acetylcholine esterase (AChE) in Daphnia magna

大型溞通過(guò)攝食來(lái)獲得生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量， 從而保證其個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和種群的延續(xù)。當(dāng)大型溞受到鎘脅迫時(shí)， 攝食率可以很好的反映其攝食能力及能量物質(zhì)的變化情況[18]。文獻(xiàn)報(bào)道， 在大型溞攝取藍(lán)藻后， 腸道內(nèi)食物的充盈度相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)不到58%， 腸道中葉綠素a含量是對(duì)照組的1/3， 表明大型溞的攝食行為受到抑制[19]。在本實(shí)驗(yàn)中， 在大型溞受到鎘脅迫后較短的時(shí)間內(nèi)， 低濃度鎘對(duì)大型溞的攝食率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異?？赡苁嵌虝r(shí)間內(nèi)， 較低濃度鎘所造成的毒害能夠被機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)修復(fù)， 不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害[20]。當(dāng)較高濃度鎘處理后， 大型溞的攝食能力受到抑制， 且攝食率與鎘蓄積量存在相關(guān)性(R2=0.9354)(表 1)。此外， 小球藻作為食物對(duì)大型溞來(lái)說(shuō)比較適口， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的環(huán)境條件(溫度和光照)也都適宜其生長(zhǎng)， 排除這些外在因素的干擾， 認(rèn)為大型溞攝食情況變化是由于鎘脅迫導(dǎo)致的。

3.2 鎘對(duì)大型溞T-AOC、MDA與AChE的影響

T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能整體狀況的綜合性指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體處于鎘脅迫時(shí)， 過(guò)多的自由基使機(jī)體內(nèi)許多重要的生物大分子發(fā)生不可逆的氧化損傷， 導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。而MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物， 可以反映在鎘脅迫下氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度[21—23]。鎘誘導(dǎo)的抗氧化能力升高可促進(jìn)ROS的清除過(guò)程； 反之， ROS的過(guò)度產(chǎn)生可以提高細(xì)胞或生物體中的MDA水平。在本實(shí)驗(yàn)中， 暴露于高濃度鎘溶液的大型溞T-AOC和MDA含量高于對(duì)照組。MDA含量的升高表明鎘的毒性對(duì)大型溞體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)造成了一定程度的損傷。而TAOC的升高是因?yàn)樵诖笮蜏惺艿芥k脅迫后， 抗氧化酶系統(tǒng)在脅迫輕微時(shí)會(huì)被激活， 來(lái)維持機(jī)體自由基的代謝平衡。因此， T-AOC的提高為代償性增高，用以清除鎘脅迫后機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧自由基。當(dāng)氧自由基水平高于機(jī)體抗氧化能力時(shí)， 將誘發(fā)氧化應(yīng)激， 并導(dǎo)致氧化損傷。脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化會(huì)對(duì)生物體組織器官造成不同程度的危害， 其中對(duì)消化道的損傷在動(dòng)物中發(fā)生率最高[24]，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收依賴于腸道蠕動(dòng)及吸收細(xì)胞的完整性和消化酶活性發(fā)揮正常的生理功能。此外， 有研究報(bào)道， 攝食率的變化與氧化應(yīng)激的相關(guān)性很高[25，26]， 這與本實(shí)驗(yàn)中鎘脅迫后大型溞體內(nèi)T-AOC與攝食率之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9521或0.9389的結(jié)果是相一致的(表 1)。所以鎘脅迫后造成機(jī)體的氧化損傷， 從而干擾了大型溞對(duì)食物的消化與吸收。

乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)傳導(dǎo)抑制劑的特異性生物標(biāo)志物， 參與乙酰膽堿的降解， 使神經(jīng)信號(hào)分子可以在生物體內(nèi)正常傳遞[27]。當(dāng)水環(huán)境中的毒物濃度較高時(shí)， 大型溞的神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)遭到破壞， 所以檢測(cè)AChE活性變化可以用來(lái)反映水體污染的情況[28]。攝食行為是維持機(jī)體代謝處理穩(wěn)恒狀態(tài)的一種調(diào)節(jié)性行為， 大型溞在攝食時(shí)， 第1、第2對(duì)胸肢的運(yùn)動(dòng)帶動(dòng)水流和食物隨進(jìn)入殼瓣， 第3、第4對(duì)胸肢上的濾器將食物濾取并凝聚成食物團(tuán)后被胸肢向上推動(dòng)最終進(jìn)入口中， 而后腹部及基部的尾爪不斷運(yùn)動(dòng)將殼瓣內(nèi)殘留物清理出殼瓣[29]。在本實(shí)驗(yàn)中， 在較高濃度的鎘(0.05 mg/L、0.09 mg/L)脅迫下大型溞體內(nèi)AChE活性降低， 可能是Cd2+以靜電吸引的形式與AChE活性中心的陰離子相結(jié)合， 造成乙酰膽堿的季銨陽(yáng)離子基團(tuán)與酶的活性中心結(jié)合的能力降低， 引起組織內(nèi)AChE活性下降， 干擾了大型溞神經(jīng)傳遞的正常功能。大型溞主要依靠其神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)調(diào)下的附肢劃動(dòng)完成攝食[30]， 毒物可以通過(guò)損害大型溞的神經(jīng)系統(tǒng)限制游泳行為和附肢運(yùn)動(dòng)來(lái)影響其濾水能力[31，32]， 最終導(dǎo)致攝食率的降低[33，34]。這與本實(shí)驗(yàn)中大型溞暴露于鎘環(huán)境較長(zhǎng)時(shí)間后攝食率與濾水率降低是一致的。

4 結(jié)論

鎘對(duì)大型溞的攝食能力具有抑制作用， 表現(xiàn)在攝食率和濾水率隨鎘處理濃度的升高而顯著下降。大型溞受到鎘脅迫后， 攝食能力降低的機(jī)制與體內(nèi)AChE活性的下降， T-AOC水平的升高及MDA含量的上升有關(guān)。

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