任芳 張尊平 范旭東 胡國君 李正男 董雅鳳

摘要

葡萄病毒B Grapevine virus B （GVB）是葡萄皺木復合病中栓皮病的病原，為開展抗GVB轉基因研究，本研究利用RTPCR技術克隆GVB外殼蛋白（coat protein， CP）基因，與植物表達載體pRI 101AN連接構建植物表達載體pRIGVB CP。采用電擊轉化法將植物表達載體pRIGVB CP導入農桿菌LBA4404，并利用農桿菌介導的葉盤轉化法將外源基因導入西方煙‘37B。共獲得16個煙草再生株系，PCR檢測其中3個株系為陽性，陽性株系播種獲得的64株T1代植株中有30株擴增到目的條帶，陽性率為46.9%，表明目的基因GVB cp成功導入煙草并可成功遺傳到子代。28株T1代轉基因植株接種病毒進行抗病性鑒定，其中有6株對接種病毒GVB具有抗性。

關鍵詞

葡萄病毒B； 外殼蛋白基因； 植物表達載體； 煙草； 遺傳轉化

中圖分類號：

S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017236

Construction of a plant expression vector of the Grapevine virus B

coat protein gene and transformation into Nicotiana tabacum

REN Fang， ZHANG Zunping， FAN Xudong， HU Guojun， LI Zhengnan， DONG Yafeng

（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Institute of Pomology，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xingcheng 125100， China）

Abstract

Grapevine virus B （GVB） is the pathogen of grapevine corky bark disease in the rugose wood complex. In order to develop transgenic plants resistant to GVB， the coat protein （CP） gene of GVB was cloned and inserted into the plant expression vector pRI 101AN and the recombinant plant expression vector pRIGVB CP was constructed. The vector pRIGVB CP was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by electric shock process， and then introduced into Nicotiana occidentalis ‘37B by Agrobacteriummediated leaf disc transformation. Totally 16 regenerated tobacco strains were obtained in this study. PCR detection indicated that three stains were positive， and 46.9 percent of 64 T1 plants were positive by PCR detection， indicating that the target gene GVB cp was successfully introduced into the tobacco and successfully inherited to the progeny. The resistance of transgenic tobacco was identified by inoculating GVB into T1 transgenic plants. The results indicated that 6 out of 28 T1 transgenic plants showed resistance to GVB.

Key words

Grapevine virus B； coat protein gene； plant expression vector； tobacco； genetic transformation

葡萄Vitis vinifera L.是我國的重要水果之一，截至2015年其產量排名為我國水果產量的第四位[1]。但同時葡萄也是感染病毒種類最多的果樹，目前國內外已報道65種病毒可侵染葡萄[2]，病毒病也逐漸成為制約我國葡萄產業(yè)化發(fā)展的重要因素之一。葡萄栓皮?。╟orky bark， CB）是皺木復合病（rugose wood complex， RW）中的一種病害類型[3]，其病原為葡萄病毒B Grapevine virus B（GVB），為線性病毒科Flexiviridae葡萄病毒屬Vitivirus的重要成員[46]。目前GVB在美國、意大利[45]、法國、南非[6]、以色列[7]、印度[8]及中國[9]等全世界多個國家普遍發(fā)生，2014年對中國不同地區(qū)的188個葡萄樣品檢測發(fā)現其中17個樣品攜帶GVB，帶毒率為9%左右[9]。GVB感染葡萄后植株將終生帶毒，難以通過化學藥劑進行有效防治，因此培育抗病品種是防控葡萄病毒病的重要途徑，利用基因工程導入外源基因是抗病育種的一種有效輔助手段。目前葡萄抗病毒基因工程主要利用病毒外殼蛋白（coat protein，CP）和移動蛋白（movement protein，MP）等病毒來源的基因作為抗性基因，并獲得了抗病毒植株[1011]。這一類基因誘導植株產生針對來源病毒的特異抗性。田莉莉等[1213]為創(chuàng)制針對葡萄病毒的廣譜抗病毒植物新材料，分別將2種和4種葡萄病毒部分cp基因片段串聯構建RNAi干擾植物表達載體，分別轉入煙草和葡萄體細胞胚，抗性效果有待進一步評價。除病毒源基因外，一些非病毒來源的基因也被應用于抗病毒基因工程，如郭佩佩等[14]利用大豆凝集素基因lecs轉化煙草增強了植株對煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）的抗性；本實驗室曾將一種廣譜性抗病毒基因酵母pac1基因導入煙草，所獲得的部分轉基因植株對GVB表現出一定的耐病性，但并不能完全抵抗病毒的侵染[15]，因此還需探索和研究誘導抗性更強的外源基因。利用病毒cp基因培育抗病毒植株已有一些成功案例[1011]，但由于轉基因葡萄植株培育、抗性評價等周期長、難度大，因此選擇煙草等模式植物開展轉基因研究，可快速獲得轉基因煙草植株并進行抗性評價，如RadianSade等[16]、Ling等[17]、JardakJamoussi等[18]將GVA 、GFLV、或GLRaV2等葡萄病毒cp或mp基因導入煙草獲得轉基因植株，通過摩擦接種轉基因煙草觀察癥狀表現快速進行抗性評價，初步篩選出抗病或耐病株系。有關GVB cp基因的遺傳轉化研究目前國內尚罕見報道，本實驗室研究證明西方煙Nicotiana occidentalis‘37B接種GVB后，會出現明顯褪綠、黃化、皺縮畸形等癥狀[15]，有助于快速進行抗病性評價，因此本研究將GVB cp基因作為目的基因導入該煙草，為評價其抗病毒效果、培育抗性更強的轉基因植株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

用于GVB cp基因克隆的毒源為GVB帶毒葡萄植株摩擦接種的西方煙N.occidentalis‘37B組培苗，由本實驗室保存；用于遺傳轉化的健康西方煙‘37B組培苗由本實驗室保存。

1.2 載體、菌株及主要試劑

大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)、農桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404電擊轉化感受態(tài)、克隆載體pMD 19T、植物表達載體pRI 101AN、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PCR相關試劑等均購自TaKaRa公司（大連）；質粒提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；6芐氨基腺嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、萘乙酸（naphthylacetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indolebutyric acid，IBA）、鏈霉素（streptomycin，Sm）卡那霉素（kanamycin，Km）、頭孢霉素（cefotaxime sodium，Cef）等激素和抗生素購自美國Sigma公司。

1.3 GVB cp基因的克隆

根據GenBank登錄的GVB序列利用軟件Primer premier 5.0及Oligo 6.0設計擴增GVB cp基因全長的引物：B8ABam（5′CAGGATCCTACGAGACAATAAGCAAGC3′），B8BSac（5′CCGAGCTCCACCCAAATACTTAGACATAC3′），上下游引物5′端分別添加Bam HⅠ和SacⅠ酶切位點。參照任芳等[19]的方法，從實驗室保存的GVB毒源煙草組培苗中RTPCR擴增cp基因，連接到pMD 19T載體，轉化DH5α 感受態(tài)，PCR篩選陽性克隆（pMDGVB CP）并進行測序和酶切驗證。采用DNAStar 7.0和MEGA 7.0.14 軟件進行序列分析和比對。多序列比較采用DNAstar Clustal V方法。

1.4 植物表達載體的構建及轉化農桿菌

植物表達載體構建流程見圖1，利用限制性內切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對pMDGVB CP質粒和pRI 101AN載體雙酶切，膠回收目的基因片段和線性化載體大片段，T4 DNA連接酶連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，PCR篩選陽性克?。╬RIGVB CP）并進行測序和酶切驗證。提取pRIGVB CP質粒DNA，利用美國BIORAD公司Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng)電擊轉化農桿菌LBA4404感受態(tài)。轉化步驟：取20 μL感受態(tài)細胞置于冰上融化，加入2 μL質粒DNA；將混合液加入冰中預冷的BIORAD 電極間距0.1 cm的電擊杯內，2 400 V電擊2次；迅速置于冰上冷卻，然后加入1 mL SOC培養(yǎng)基，30℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)1 h；取適量菌液涂布于含卡那霉素（Km）100 mg/L和鏈霉素（Sm）100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，挑斑培養(yǎng)，菌液PCR鑒定篩選陽性克隆。

1.5 煙草遺傳轉化及再生植株培育

參照任芳等[15]的葉盤法進行煙草遺傳轉化，將含重組質粒pRIGVB CP的農桿菌菌液振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時低速離心收集沉淀，沉淀用MS液體培養(yǎng)基重懸作為侵染源。將煙草無菌組培苗葉片剪成0.5～1.0 cm2的小塊，在上述菌懸液中浸泡10 min，無菌濾紙吸干多余菌液，接種于分化培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+100 μmol/L乙酰丁香酮）上27℃暗培養(yǎng)3 d，然后轉至含Km和Cef的選擇培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Km+250 mg/L Cef）于（25±2）℃、L∥D=16 h∥8 h條件下培養(yǎng)，每月繼代培養(yǎng)1次，誘導產生抗性芽，待不定芽長至1～2 cm時將其切下轉到生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.5 mg/L IBA+25 mg/L Km+150 mg/L Cef）誘導生根直至獲得完整再生植株。

1.6 轉基因植株PCR檢測

取再生植株葉片采用CTAB法提取基因組DNA，提取步驟參照北京艾德萊生物科技有限公司CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書，采用引物B8ABam/B8BSac對DNA模板進行PCR檢測，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。收集陽性T0代植株種子播種，培育T1代植株，同樣采用引物B8ABam/B8BSac進行PCR檢測鑒定陽性植株。

1.7 轉基因植株抗病性初步鑒定

在轉基因T1代陽性植株6葉期左右，取感染GVB的試管苗毒源摩擦接種轉基因煙草，同時接種非轉基因煙草為對照，觀察轉基因植株及對照植株癥狀表現，在接種后15 d和30 d分別采集植株葉片提取總RNA，采用引物GVBh/GVBc（GVBh：5′ATCAGCAAACACGCTTGAACCG3′，GVBc：5′GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC3′）進行RTPCR檢測確定植株中帶毒情況。

2 結果與分析

2.1 GVB cp基因的克隆

引物B8ABam/ B8BSac從實驗室保存的毒源煙草中均擴增到約704 bp的目的片段（圖2a）?？寺‘a物菌液PCR鑒定（圖2b）和Bam HⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定（圖2c）表明成功獲得陽性克隆pMDGVB CP。陽性克隆經測序共獲得11個GVB cp序列，包含完整GVB cp基因（594 bp）及兩端引物和酶切位點序列。這些cp基因克隆序列相似性達98.8%～100%，與GenBank登錄的GVB cp序列核苷酸相似性為77.9%～98.8%，其中與登錄號X75448分離物相似性最高，達97.5%～98.5%，在進化樹上也聚在一個分支。本研究所獲得的11個克隆序列中僅有2個克隆序列共3個氨基酸差異，其余9個克隆均沒有氨基酸突變，并且其中有6個克隆氨基酸和核苷酸序列均完全一致，表明這些序列為優(yōu)勢序列，選取其中的克隆991作為載體構建的目的片段。

2.2 植物表達載體pRIGVB CP構建及轉化農桿菌

用BamHⅠ和SacⅠ分別對克隆質粒pMDGVB CP和載體pRI 101AN進行雙酶切、回收和轉化DH5α，克隆產物PCR擴增除1個克隆未擴增到目的條帶外其余克隆均獲得目的條帶（圖3a）。陽性克隆質粒DNA雙酶切鑒定獲得兩條條帶，其中小片段為cp基因，大片段為切下的載體片段（圖3b）。陽性克隆測序結果顯示未發(fā)生堿基突變，表明植物表達載體pRIGVB CP構建成功。將植物表達載體pRIGVB CP質粒DNA電擊轉化農桿菌LBA4404，克隆產物PCR擴增獲得約704 bp的目的條帶，表明載體成功轉入農桿菌（圖3c）。

2.3 煙草遺傳轉化及再生植株培育

含植物表達載體pRIGVB CP的農桿菌共浸潤煙草葉盤（圖4a），暗培養(yǎng)3 d后轉入含Km和Cef的選擇培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)，約4周后開始產生抗性不定芽（圖4b）。待不定芽長至1～2 cm時切下不定芽轉到生根培養(yǎng)基上誘導生根（圖4c），成功獲得完整再生植株（圖4d）。在Km和Cef篩選下共獲得再生煙草16株。

2.4 轉基因煙草的PCR鑒定

采用引物B8ABam/ B8BSac對16株再生煙草植株的PCR鑒定結果表明，其中有3株擴增到約704 bp的目的條帶，陰性對照和其余植株未擴增到目的條帶（圖5）。收集陽性T0代植株種子播種，對3個陽性株系共64株T1代植株進行PCR檢測，其中30株擴增到目的條帶，陽性率46.9%，表明目的基因GVB cp基因成功導入煙草并可成功遺傳到子代植株。

2.5 轉基因煙草抗病性初步鑒定

在轉基因T1代陽性植株6葉期左右接種GVB毒源，共接種28株，同時接種10株非轉基因煙草為對照。接種后15 d，所有非轉基因植株新葉均出現褪綠、黃化、皺縮畸形及葉片變小等癥狀，接種的轉基因T1代陽性植株中有22株出現與非轉基因對照相似的癥狀，另外有6株未觀察到明顯癥狀（圖6）。分別提取轉基因T1代接種后無癥狀植株（6株）、轉基因T1代接種發(fā)病植株（4株）、非轉基因接種發(fā)病植株（4株）及非轉基因未接種健康植株（2株）總RNA，采用引物GVBh/GVBc進行RTPCR檢測。結果表明，轉基因T1代接種發(fā)病植株和非轉基因接種發(fā)病植株中均擴增到GVB目的條帶，轉基因T1代接種后無癥狀植株及非轉基因未接種健康植株中均未擴增到GVB目的條帶（圖7）。接種后30 d再次采集相同植株葉片，RTPCR檢測GVB帶毒情況與接種15 d結果一致。因此，接種及檢測表明無癥狀的6株轉基因T1代植株中未被GVB侵染，初步表明其對GVB具有一定的抗性。

3 討論

葡萄為多年生木本植物，生長周期長且再生困難，近年來與大田作物相比葡萄抗病毒基因工程進展相對緩慢。由于在葡萄上進行轉基因植株培育、抗性評價等周期長、難度大，因此多項研究選擇煙草等模式植物進行轉基因植株培育和抗性評價[1618，20]。已有研究獲得導入GVA cp、GFLV mp、GLRaV2 cp等葡萄病毒基因的轉基因煙草，通過病毒接種及癥狀表現發(fā)現它們對同源病毒普遍具有抗性，抗性表現分為抗?。ㄖ仓暝谡麄€試驗期間均無癥狀）或耐?。ㄖ仓臧l(fā)病延遲或癥狀減弱）等類型[1618]。本實驗室此前獲得的酵母pac1轉基因煙草部分株系經病毒摩擦接種后也表現出癥狀延遲和減弱等耐病性，但仍可在植株體內檢測到病毒存在，表明不能完全抵抗病毒侵染[15]。本研究成功構建了GVB cp基因植物表達載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化成功導入煙草獲得轉基因植株。但目前轉化效率較低，陽性率僅為18%，可能與載體及菌株類型、受體材料狀態(tài)及培養(yǎng)條件等原因有關。陽性株系播種獲得的T1代植株中，陽性率達46.9%，表明目的基因可成功遺傳子代，且通過T1代植株接種病毒進行抗病性鑒定表明，其中有6株對接種病毒GVB具有抗性，表明該轉基因策略可成功獲得抗性植株。在今后試驗中將通過增加抗生素濃度及繼代培養(yǎng)次數等途徑提高轉化率，并進行轉基因植株擴繁培育以及葡萄遺傳轉化研究，為培育抗病毒植株、開展葡萄抗病毒分子輔助育種提供一定基礎。

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（責任編輯：田 喆）