胡碧輝

寧波市奉化區(qū)中醫(yī)院，浙江 寧波 315500

花生衣又稱為花生皮，是花生種子外表面的紅色(或黑色)種皮，具有止血、散瘀、消腫等功效，在臨床上被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，花生衣的抗氧化性是花生仁的50多倍[1]，對超氧陰離子、羥自由基有不同程度的清除作用，對脂質(zhì)過氧化有明顯的抑制作用[2]，而花生衣發(fā)揮抗氧化的物質(zhì)是其中所含的多酚類物質(zhì)(原花青素)、低聚原花青素(以原花青素B2為代表)、以及單體酚(以兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯為代表)，約占花生衣重量的15%[3]。低聚體及單體酚的抗氧化活性高于多聚體，因此低聚體及單體酚的含量可以作為衡量花生衣質(zhì)量的重要指標(biāo)?；ㄉ乱呀?jīng)成為多酚類抗氧化物質(zhì)的主要供應(yīng)原料之一[4]，對于作為抗氧化劑提取原料的花生衣，其酚類物質(zhì)的含量至關(guān)重要，尤其是低聚體及單體，多酚類含量測定一般采用紫外可見分光光度計(jì)法測定，如Folin-C法、Bate-Smith法、Porter法、香蘭素法等[5]；低聚體和單體的含量一般采用HPLC法。本實(shí)驗(yàn)擬對花生衣低聚體及單體的HPLC測定方法進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030型高效液相色譜儀，包括PDA檢測器、Lab-solution工作站(日本島津公司)；AF240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；CQX25-06型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

1.2 試藥 對照品兒茶素(批號：110877-201604)、表兒茶素(批號：110878-200102)、表兒茶素沒食子酸酯(批號：111987-201501)均購自中國食品藥品檢定研究院(供含量測定用)；對照品原花青素B2(上海哈靈生物科技有限公司，批號：HLZB0957，供含量測定用)；乙腈、磷酸均為色譜純(Dikma公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純；花生衣購自浙江省寧波市鄞州醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)浙江省金華市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院中藥專業(yè)陳堅(jiān)波副教授鑒定為豆科植物落花生Arachis hypogaea L.的干燥種皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6～8]Kromasil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸，梯度洗脫(見表1)；流速0.7 mL/min；柱溫30℃；檢測波長278 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

表1 梯度條件

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液的配制 分別取兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯對照品適量，精密稱定，加溶解液[乙腈-0.3%磷酸(9∶1)]溶解并制成每1 mL含兒茶素387.4 μg、原花青素B2 389.5 μg、表兒茶素 401.6 μg、表兒茶素沒食子酸酯376.3 μg的混合溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制[9]取過80目篩的花生衣樣品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶解液[乙腈-0.3%磷酸(9∶1)]50 mL，密塞，稱定重量。超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用溶解液[乙腈-0.3%磷酸(9∶1)]補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 見圖1～2。精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液、2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。供試品色譜圖中，兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的保留時(shí)間與相應(yīng)對照品色譜圖一致。

圖1 混合對照品HPLC色譜圖

圖2 供試品HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液，分別進(jìn)樣4、6、10、15、20、30 μL，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，以對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程依次為：Y=5.367×105X+1.231×104，r=0.999 7；Y=5.639×105X+1.475×104，r=0.999 5； Y=6.151 ×105X+4.007 ×103，r=0.999 6；Y=4.874×105X+3.277×104，r=0.999 6。上述結(jié)果表明兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯分別在 0.155～1.162 μg、0.156～1.168 μg、0.161～1.204 μg和 0.151～1.128 μg 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件先后重復(fù)測定6次。結(jié)果兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯峰面積的RSD分別為1.1%、0.93%、0.84%和1.3%，結(jié)果表明儀器具有較好的精密度。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批花生衣樣品6份，分別依照2.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果花生衣中兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的平均含量分別為 1.96、3.83、5.08、8.29 mg/g，RSD分別為2.1%、1.8%、1.8%和1.5%，結(jié)果表明本測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下的1份供試品溶液，分別于配制后的2、4、6、8、10 h測定兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的峰面積。結(jié)果兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的峰面積的RSD分別為2.3%、2.3%、2.0%和1.9%，結(jié)果表明供試品溶液在配制后的10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 見表2。取已知檢測物質(zhì)含量(兒茶素1.96 mg/g、原花青素B2 3.83 mg/g、表兒茶素5.08 mg/g、表兒茶素沒食子酸酯8.29 mg/g)的花生衣粉末(過80目篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液(兒茶素99.4 μg/mL、原花青素 B2 194.2 μg/mL、表兒茶素 259.7 μg/mL、表兒茶素沒食子酸酯406.5 μg/mL)20 mL和溶解液[乙腈-0.3%磷酸(9∶1)]30 mL，密塞，稱定重量，其余依照2.2.2項(xiàng)下方法操作，平行制得供試品溶液6份，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。

2.4 樣品含量測定 見表3。取不同批次花生衣樣品各3份，依照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。

3 討論

花生衣雖然尚未載入《中國藥典》，但目前已被收入《全國中草藥匯編》，可以作為藥食兩用原料。當(dāng)前花生衣的收集利用不夠充分，花生在榨取花生油前需剝除花生衣，大眾在食用花生仁時(shí)，也有撮掉花生衣的習(xí)慣，大量的花生衣被廢棄，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[10]。隨著研究的深入，越來越多的人意識到花生衣的重要性，希望更多的花生衣被作為中藥應(yīng)用，或者作為多酚類抗氧化物質(zhì)的來源用于提取多酚提取物，用于食品、保健品或者作為添加劑用于飼料中。

表2 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

表3 不同批次花生衣中4種成分的含量 (n=3) mg/g

兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯在203 nm和278 nm處有最大吸收，鑒于203 nm為近紫外波長，多數(shù)雜質(zhì)成分在此波長處均有吸收，會(huì)導(dǎo)致干擾峰增多，進(jìn)而降低測試的專屬性和準(zhǔn)確度，因此本研究選擇278 nm為檢測波長。為縮短分析時(shí)間，提高分析效率，本研究采取梯度洗脫方式，在目標(biāo)峰顯示完全后，增大乙腈的比例，提高洗脫溶劑的洗脫能力。為提高目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰的分離度，本研究將洗脫速度降為0.7 mL/min。

從本研究收集的3批花生衣測試結(jié)果來看，4種成分中，兒茶素的含量相對較低，表兒茶素沒食子酸酯的含量相對較高，4種成分之和占花生衣重量的1.5%～1.9%。

本研究建立的方法能同時(shí)對花生衣中4種成分進(jìn)行含量測定，具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，數(shù)據(jù)表明所建立的方法具準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

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