李憲偉，鄭洪亮，趙宏偉，王敬國，劉化龍，孫 健，李 寧，雷 蕾，鄒德堂

(東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球有1/2以上的人口以水稻為主食[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國水稻的種植面積約占世界水稻種植面積的1/5，位居全球第二[2]。土壤鹽堿化是制約我國水稻穩(wěn)定生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一。然而，由于氣候變暖、工業(yè)污染加上錯誤的灌溉方式等諸多環(huán)境及人為因素使土壤鹽堿化程度日趨嚴重，使之逐漸成為阻礙作物高產(chǎn)、威脅糧食安全的主要因素。因此，深入了解水稻在鹽堿脅迫下的響應與遺傳機制，發(fā)掘和利用耐鹽堿相關基因，通過育種手段改良品種的耐鹽堿性，是提高鹽堿地生產(chǎn)力的一項經(jīng)濟有效的措施[3]。黑龍江省是我國水稻的主產(chǎn)區(qū)之一，其粳稻品種的種植面積居全國首位[4]。然而，黑龍江省鹽堿地面積達134萬hm2，占黑龍江省耕地面積的7%[5]。所以開展黑龍江省鹽堿地水稻種植對于鹽堿地改良及國家糧食安全均有重要意義。黑龍江省地處松嫩平原，鹽堿土壤以蘇打鹽堿土為主，土壤成分復雜，主要成分為碳酸鈉和碳酸氫鈉[6]。前人大多數(shù)直接利用氯化鈉和碳酸鈉水溶液對水稻進行鹽堿脅迫的模擬試驗，解析水稻耐鹽堿性[7]。相對而言，利用蘇打鹽堿土進行脅迫研究更具有實際意義。

近些年來，由于水稻直播具有勞動強度低，省工、省本、省秧田、高效等優(yōu)點[8]，在濱海鹽漬土及東北蘇打鹽堿土稻區(qū)甚至全球范圍內(nèi)迅猛發(fā)展，已經(jīng)成為一種重要的栽培方式[9]。水稻的各個生長發(fā)育階段都會受到鹽堿土壤的危害，而與其他發(fā)育時期不同的是，鹽堿土稻區(qū)的水稻直播田在水稻芽期就已經(jīng)開始產(chǎn)生不同程度的鹽堿危害，通常會降低水稻的成苗率，破壞有效光合群體的建立，進而導致水稻產(chǎn)量的降低。因此，研究水稻芽期耐鹽堿性遺傳機制，發(fā)掘和利用耐鹽堿相關基因，培育適合蘇打鹽堿土直播的水稻新品種對于提高鹽堿土生產(chǎn)力具有重要意義。目前，關于水稻種子的耐鹽堿性鑒定及QTL定位均是在NaCl、Na2CO3或NaHCO3水溶液脅迫下考察種子的萌發(fā)能力[10]，即水稻的發(fā)芽期耐鹽堿性，而在實際水稻生產(chǎn)中往往是將水稻種子催芽后應用于直播生產(chǎn)或育苗移栽。因此，研究蘇打鹽堿脅迫下水稻幼芽細胞維持生活，進而誘發(fā)成綠苗的能力更具有實際意義，而針對東北地區(qū)蘇打鹽堿脅迫下的水稻芽期耐鹽堿鑒定及基因挖掘尚無報道。

在21世紀初期，Remington等[11]首次成功地將關聯(lián)分析引入植物。到目前為止，關聯(lián)分析已經(jīng)被廣泛應用于玉米、擬南芥、水稻和大豆等眾多植物中[12-15]，且在植物的耐鹽性研究中已有報道[16-17]。隨著水稻全基因組測序的完成，關聯(lián)分析的方法在發(fā)掘水稻數(shù)量性狀基因的廣度和精度等方面體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢[6]，已成為基因組學研究的熱點之一。但到目前為止，利用關聯(lián)分析的方法進行水稻芽期耐鹽堿研究還鮮有報道。

基于以上原因，本研究以176份粳稻組成的自然群體為試驗材料，采用黑龍江省大慶地區(qū)中度蘇打鹽堿土進行芽期耐鹽堿性鑒定，利用154對SSR標記進行關聯(lián)分析，以期獲得與蘇打鹽堿脅迫下顯著關聯(lián)的位點及相應載體材料，為培育適合鹽堿地種植的水稻品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以176份具有廣泛地理分布的粳稻品種為材料(表1)。其中有15份材料來自中國遼寧，30份材料來自中國吉林，58份材料來自中國黑龍江，45份材料來自日本，7份材料來自朝鮮，7份來自俄羅斯，14份材料來自韓國。

1.2 粳稻芽期耐鹽堿性鑒定

本試驗在東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院水稻研究所實驗室進行。采用大慶地區(qū)中度蘇打鹽堿土作為脅迫處理，土壤基本情況見表2。每份材料選取50粒飽滿的種子放入45 ℃恒溫箱中，處理48 h，使種子打破休眠，用3%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，用自來水沖洗3次后，放入蒸餾水中進行催芽，以種子芽長等于種子長度1/2為發(fā)芽標準。將50粒種子播入已經(jīng)加好20 g鹽堿土的培養(yǎng)皿中放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，試驗重復3次。分別于第13天和第18天每個品種收獲地上部分，用蒸餾水浸洗后置于80 ℃烘箱烘干48 h至恒重，分析天平稱重后用100 mmol/L醋酸于90 ℃恒溫水浴箱中提取2 h，其間晃動一次，用蒸餾水稀釋至一定倍數(shù)，用M410型火焰光度計測定地上部Na+濃度(Shoot Na+concentration，SNC)和K+濃度(Shoot K+concentration，SKC) ，并進一步計算地上部Na+/K+(Shoot Na+/K+radio，SNK)，同時在處理第18天時，參照水稻鹽害評價體系的標準劃分每個品種的鹽堿害級別[18](表3)。

表1 176份材料名稱與來源 Tab.1 Name and source of the 176 accessions

表1(續(xù))

表2 蘇打鹽堿土壤基本情況Tab.2 Soil basic situation of soda saline-alkali

表3 水稻鹽堿害評價標準Tab.3 Evaluation criteria for salt and alkali damage in rice

1.3 DNA提取及SSR標記分析

按照CTAB法提取DNA[19]，稍有改進。參照http：//www.gramene.org中的引物數(shù)據(jù)，選擇均勻分布于水稻12條染色體上的SSR引物1 000對，由博仕生物技術有限公司合成。利用154個具有多態(tài)性的SSR標記進行關聯(lián)分析。

PCR反應體系為20 μL[20]。擴增結果采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 表型數(shù)據(jù)基本統(tǒng)計分析 利用Excel 2010軟件計算性狀的平均值、標準差及變異系數(shù)等表型數(shù)據(jù)。

1.4.2 群體結構分析 使用STRUCTURE 2.2軟件進行群體結構分析[22]。如果對數(shù)似然值 lnP(D) 隨亞群數(shù) K 值的增大而增大，則采用 ΔK 來確定合適的 K 值。ΔK 的計算方法是 | L″(K) | 的平均數(shù)除以 L′(K) 的標準差，其中，L′(K) = L(K)-L(K-1)，| L″(K) | = | L′(K+1) -L′(K) |，STRUCTURE 2.2軟件運行結果中的lnP(D)值即為L(K)[22-23]。

1.4.3 連鎖不平衡分析 使用D′ 值和r2值作為衡量標記位點間連鎖不平衡( Linkage disequilibrium，LD) 程度的標準。其中稀有等位變異(等位變異頻率<5%)作為缺失處理。r2值的理論變化范圍為0～1，LD越高，連鎖越緊密。

1.4.4 耐鹽堿相關性狀與SSR標記的關聯(lián)分析 運用TASSEL 3.0軟件中的GLM和MLM模型分別進行性狀與標記的關聯(lián)分析。將STRUCTURE 2.2軟件運行后形成的Q值作為協(xié)變量，然后利用標記變異分別對水稻耐鹽堿相關性狀的表型值逐一進行回歸分析，找出與性狀關聯(lián)的SSR標記位點[22]。當P≤0.01時認為該標記與目標性狀關聯(lián)。

1.4.5 優(yōu)異等位變異挖掘 在關聯(lián)分析的基礎上，參照Zhang等[24]提出的方法進行優(yōu)異等位變異的挖掘。以群體平均值為對照，估算關聯(lián)位點等位變異的表型效應值(表型效應值的計算方法為優(yōu)異等位基因的性狀平均值與群體平均值的差值[25])，同時列出攜帶該等位基因的5個最佳品種。

2 結果與分析

2.1 蘇打鹽堿脅迫下粳稻芽期耐鹽堿性鑒定

分別對176份粳稻種質(zhì)的SNC、SKC、SNK及SDG等芽期耐鹽堿相關性狀進行統(tǒng)計分析(表4)。可以看出，176份粳稻種質(zhì)資源13 d的SNC、SKC和SNK的3個指標平均值低于18 d的取樣結果。18 d的取樣結果變異范圍和變異系數(shù)均大于13 d的取樣結果。其中，18 d SKC變異系數(shù)最大，達到46.55%；18 d SNC變異范圍最大，達到6.78～115.44。從性狀的極值來看，品種間的變異范圍較大，多樣性較為豐富。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布的適合性檢驗，發(fā)現(xiàn)除SNK以外，其他各個性狀的偏度和峰度的絕對值均小于1，說明這些性狀基本符合正態(tài)分布，呈現(xiàn)典型的數(shù)量性狀遺傳模式。同時，對比表型數(shù)據(jù)可以得知，隨著處理時間增加，鈉離子濃度、鉀離子濃度及鈉鉀比均呈現(xiàn)增長趨勢。

表4 自然群體耐鹽堿性表現(xiàn)Tab.4 Salt tolerance and alkaline expression in natural population

2.2 群體結構分析

利用176個水稻品種在154對SSR引物擴增下的基因型數(shù)據(jù)，結合STRUCTURE 2.2軟件對該自然群體進行群體結構分析。結果對數(shù)似然值LnP(D)隨亞群數(shù)K增大而增大，無法確定最適宜的亞群數(shù)。因而，采用ΔK方法分析(圖1)。當K=3時，ΔK達到最大值，因此，判斷樣本亞群數(shù)為3，分別命名為P1、P2、P3(圖2)。采用STRUCTURE軟件計算出每個品種歸屬于3個亞群的后驗概率值，以此來劃分每個品種所歸屬的亞群。P1包括47份材料，P2包括71份材料，P3包括14份材料，還有44份材料被劃入混合組(MIX)。K為3時各材料的Q值被用于下一步關聯(lián)分析。

2.3 連鎖不平衡分析

使用 TASSEL 3.0 軟件對上述3個亞群154個SSR標記位點間的連鎖不平衡狀況進行了分析(圖3)，計算出所有可能位點組合的D′值和r2值，用于評價群體的連鎖不平衡程度，其中稀有等位變異(等位變異頻率<5%)作為缺失處理。評價位點間存在顯著的連鎖不平衡的標準是P≤0.01。圖3用于直觀顯示處于 LD 狀態(tài)的位點組合。用不同的顏色表示每對多態(tài)性位點之間的D′值及Fisher精確檢驗的P值(顯著性)，連鎖不平衡現(xiàn)象越明顯則顏色更偏向紅色，圖3中右下角為P值，右上角為D′。發(fā)現(xiàn)無論是共線(同一染色體上)SSR位點之間，還是非共線(不同染色體間)SSR標記位點之間均存在一定程度的連鎖不平衡。

2.4 粳稻芽期相關耐鹽堿性狀與SSR標記位點的關聯(lián)分析

通過TASSEL軟件的GLM和MLM模型分別對脅迫13，18 d的耐鹽堿相關性狀進行關聯(lián)分析。檢測到的與4個耐鹽堿相關性狀顯著關聯(lián)的SSR位點共有13個，累計34次顯著關聯(lián)(P≤0.01)，分布在除第2，3，9，12外的8條染色體上(表5)。共有8個位點在GLM和MLM模型中同時被檢測到。

LnP(D)隨亞群數(shù)K的變化LnP(D)for K from 1 to 10

ΔK隨亞群數(shù)K值的變化曲線ΔK for K from 2 to 10

圖2 STRUCTURE 2.2檢測的群體結構Fig.2 STRUCTURE 2.2 detection of the population structure

圖3 154個SSR位點間的連鎖不平衡分布Fig.3 Linkage disequilibrium between 154 SSR locis

脅迫13 d條件下，共檢測到與耐鹽堿相關性狀顯著關聯(lián)SSR標記6個，在2種模型下均檢測出的標記有4個，其中，與SNC-13相關聯(lián)的標記為RM471，位于第4條染色體上，在GLM和MLM 2種模型的貢獻率分別為6.37%，9.30%；在2種模型下同時檢測到與SKC-13顯著關聯(lián)的標記有2個，分別為位于第1，6染色體的RM1254和RM527；與SNK-13相關聯(lián)的標記為位于第11條染色體上的RM1219，在GLM和MLM 2種模型的貢獻率分別為6.88%，9.62%。

脅迫18 d條件下，共檢測到與耐鹽堿相關性狀顯著關聯(lián)的SSR標記有10個(累計14次顯著關聯(lián))，在2種模型下同時檢測出的標記有7個(累計10次顯著關聯(lián))，其中，與SDG-18顯著關聯(lián)的位點有2個，分別是位于第5和第11染色體上的RM200和RM1219；與SNC-18顯著關聯(lián)的標記有3個，分別是位于第4染色體上的RM241和RM471，及位于第11染色體上的RM286；與SKC-18顯著關聯(lián)的標記有2個，分別是位于第6和第11染色體上的RM527和RM286；與SNK-18相關聯(lián)的標記有3個，分別是位于第11染色體上的RM286和RM1219，以及位于第10染色體上的RM228。

在2種模型下共檢測到4個位點同時與2個或2個以上性狀顯著關聯(lián)。分別是與SKC-13和SKC-18關聯(lián)的RM527；與SNC-13和SNC-18顯著關聯(lián)的RM471；與SNK-13、SNK-18和SDG-18顯著關聯(lián)的RM1219；與SKC-18、SNC-18和SNK-18相關聯(lián)的RM286。

2.5 優(yōu)異等位基因及載體材料

將本研究在2種模型中同時檢測到的8個位點(累計14次顯著關聯(lián))進一步挖掘到24個優(yōu)異等位變異，同時列出攜帶該等位變異的5個最佳品種(表6)。對于地上部鈉離子濃度、地上部鈉鉀比和鹽堿害級別這3個性狀來說，優(yōu)異等位變異的性狀平均值要低于群體平均值，所以表型效應值為負數(shù)，而對地上部鉀離子濃度來說，優(yōu)異等位變異的性狀平均值要高于群體平均值，所以表型效應值為正數(shù)。以下載體材料具有耐鹽堿的優(yōu)異等位變異，可作為育種中間材料進行水稻耐鹽堿種質(zhì)資源改良。

表5 蘇打鹽堿土脅迫下與粳稻芽期耐鹽堿性相關性狀的相關位點及表型變異的解釋率Tab.5 The explanation of the related loci and phenotypic variation of salt-tolerance-related traits during Japonica rice seedling stage under the stress of soda saline soil

注：SNC-13、SKC-13、SNK-13代表13 d取樣結果；SDG-18、SNC-18、SKC-18、SNK-18代表18 d取樣結果。表6同。

Note：SNC-13，SKC-13，SNK-13 represent 13 d sampling results；SDG-18，SNC-18，SKC-18，SNK-18 represent 18 d sampling results.The same as Tab.6.

表6 蘇打鹽堿土脅迫下與粳稻芽期耐鹽堿性相關的優(yōu)異等位變異及載體材料Tab.6 Salinity and alkali-tolerant excellent allelic variation and carrier materials during Japonicarice seedling stage under the stress of soda saline soil

表6(續(xù))

3 討論與結論

關聯(lián)分析是剖析復雜性狀遺傳基礎的重要方法[33]。水稻的耐鹽堿性是由多基因控制的數(shù)量性狀[34]。尋找并控制水稻耐鹽堿性的全部QTL，同時進行基因聚合對于提高水稻的耐鹽堿性具有重要的意義。本研究所用的自然群體包括176個粳稻品種，這些品種具有廣泛的地理分布，群體遺傳變異較大。分別對13，18 d的取樣結果分析可知，隨處理時間增加，SNC、SKC和SNK的表型數(shù)值在平均數(shù)、變異范圍等方面均有增加。同時，本試驗與前人研究內(nèi)容所不同的是，本試驗針對水稻直播的種植方式，直接使用大慶地區(qū)標志性的中度蘇打鹽堿土進行脅迫處理，使研究更具有實際意義。

本研究利用176個粳稻品種組成的自然群體對SNC、SKC、SNK、SDG等4個耐鹽堿相關性狀進行了關聯(lián)分析，在GLM和MLM 2種模型下共檢測到了13個顯著關聯(lián)的位點，其中，有8個位點在2種模型下均被檢測出顯著關聯(lián)。進一步利用這些位點挖掘到24個優(yōu)異等位變異及相應的載體材料。為了提高育種效率，可以利用這些等位變異及其相應的載體材料進行粳稻芽期耐鹽堿性狀的改良，以期獲得耐鹽堿性優(yōu)異的粳稻品種。

到目前為止，國內(nèi)外在模擬鹽堿條件下對水稻的耐鹽堿性QTL定位進行了大量的研究[20，34-36]。本試驗在2種模型條件下都檢測到的與耐鹽堿性狀顯著關聯(lián)的8個位點中，7個為前人已經(jīng)報道過的位點，1個為新發(fā)現(xiàn)的位點。通過比較相同標記和圖譜，將本研究檢測到的與耐鹽堿性狀相關聯(lián)的位點與前人結果進行比較，發(fā)現(xiàn)位于第5染色體上與SDG-18顯著關聯(lián)的RM200與影響水稻耐鹽指數(shù)的標記一致[24]。位于第4染色體上與SNC-13顯著關聯(lián)的RM471與Liang等[26]的研究結果中影響水稻死苗率的qDSRs4-2在同一染色體區(qū)段。位于第6染色體上的RM527與影響水稻地上部鉀離子濃度的標記一致[27]。位于第1染色體上的RM1254與Wang等[28]檢測到的與水稻種子發(fā)芽活力性狀的標記一致。位于第4染色體上的RM241與Cheng等[30]研究結果中影響水稻在鹽脅迫下存活率的QTL在相同染色體區(qū)段。RM1219在前人研究中未見報道。另外，本研究檢測到的RM471、RM1219、RM527和RM286均與2個或2個以上性狀顯著關聯(lián)。其中，RM1219與SNK-13、SNK-18和SDG均顯著關聯(lián)，同時RM1219也是在本研究中檢測出的1個新位點，在前人研究中未見報道。很可能是與粳稻芽期耐鹽堿性相關的新位點。關聯(lián)分析能夠有效、快速、準確地檢測到與粳稻芽期耐鹽堿性相關聯(lián)的位點。本研究使用176份粳稻種質(zhì)組成的自然群體，針對4個耐鹽堿性狀進行了粳稻芽期耐鹽堿性鑒定，獲得與粳稻芽期耐鹽堿性顯著關聯(lián)的8個位點。同時挖掘出24個相關的優(yōu)異等位基因及其相應的載體材料?？梢岳靡陨涎芯恐贫ㄟm合黑龍江省鹽堿地種植的粳稻品種。

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