任方媛，李 高，張 濤，楊 杞，王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

木質(zhì)素是維管植物中廣泛存在的芳香族多聚物，主要由羥基肉桂醇衍生而來(lái)，廣泛分布于維管植物中[1]。維管植物生物量的20%～30%是木質(zhì)素，是含量?jī)H次于纖維素的第二大類(lèi)有機(jī)物質(zhì)，也是最大的一類(lèi)次生代謝物質(zhì)。植物進(jìn)化過(guò)程中木質(zhì)素的產(chǎn)生被認(rèn)為是陸生植物繁盛的關(guān)鍵原因之一[2]。木質(zhì)素主要存在于植物的次生壁中，它與纖維素、半纖維素共價(jià)結(jié)合在一起，可以使植物細(xì)胞有足夠的硬度和強(qiáng)度，能夠幫助植物免受侵蝕，從而抵抗外界不良環(huán)境所帶來(lái)的危害[3]。在不同種類(lèi)植物和不同組織中木質(zhì)素的分布與它的功能密切相關(guān)。木質(zhì)素通常沉積于次生細(xì)胞壁中，而不存在于初生細(xì)胞壁中[4]。木本植物維管組織高度木質(zhì)化，以保證為長(zhǎng)距離的水分運(yùn)輸提供機(jī)械支持力[5]。過(guò)去認(rèn)為，木質(zhì)素只存在于維管植物中，而近些年來(lái)的研究顯示，苔蘚和紅藻中也存在木質(zhì)素或木質(zhì)素的類(lèi)似物，而綠藻中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素[6]。

木質(zhì)素主要由松柏醇、芥子醇、香豆醇3種醇類(lèi)單體聚合而來(lái)，其中，S型木質(zhì)素(紫丁香基木質(zhì)素)是由紫丁香基丙烷單體聚合形成的，而愈創(chuàng)木基丙烷單體聚合形成的是G型木質(zhì)素(愈創(chuàng)木基木質(zhì)素)，H型木質(zhì)素(對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素)則是對(duì)-羥基苯基丙烷單體聚合形成的[7]。當(dāng)其合成途徑受到阻礙或干擾后，一些新的單體形式也會(huì)出現(xiàn)，參與到木質(zhì)素的聚合過(guò)程中來(lái)[8-9]。H型和G型木質(zhì)素在所有的維管植物中都存在，而S型木質(zhì)素目前發(fā)現(xiàn)只在顯花植物和卷柏屬中存在[10]。

阿魏酸-5-羥基化酶(Ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H)是合成S型木質(zhì)素的關(guān)鍵酶，是木質(zhì)素合成中的第3個(gè)細(xì)胞色素P450單氧化酶。F5H最早僅在顯花植物中發(fā)現(xiàn)，最近的研究表明，卷柏中也存在F5H[11]。如果F5H的活性被抑制，S型木質(zhì)素含量會(huì)大大下降甚至消失。擬南芥F5H基因突變體f5h1-2中S型木質(zhì)素幾乎消失[12]。在植物中過(guò)量表達(dá)F5H基因，木質(zhì)素的組成中S型木質(zhì)素會(huì)大量增加[13]。由此可見(jiàn)，在S型木質(zhì)素合成中F5H基因是最為重要的基因。

檸條錦雞兒(CaraganakorshinskiiKom.)是錦雞兒屬多年生灌木，根系龐大，在內(nèi)蒙古地區(qū)分布極廣，在蒙古和西亞也有分布[14]。檸條錦雞兒抗旱、抗冷、耐鹽堿和貧瘠，是我國(guó)西北干旱荒漠地區(qū)植樹(shù)造林的重要樹(shù)種。其根系發(fā)達(dá)，分蘗能力較強(qiáng)，檸條林可以起到防風(fēng)固沙、保持水土的作用，此外，它還是一種具有極大生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的灌木，作為豆科植物，同其他豆科飼草一樣具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是我國(guó)北方地區(qū)重要的飼草[15-16]。極強(qiáng)的抗逆性又使得檸條錦雞兒具備了其他飼用植物沒(méi)有的優(yōu)良特性，可以在干旱荒漠地區(qū)進(jìn)行生態(tài)造林的同時(shí)利用到飼料和工業(yè)生產(chǎn)中去，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17]。

目前，F(xiàn)5H基因已從水稻(Oryzasativa)、紫苜蓿(Medicagosativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、楊樹(shù)(Populustrichocarpa)、番茄(Lycopersiconesculentum)、油菜(Brassicanapus)等植物中分離克隆出來(lái)[18-20]。但是關(guān)于檸條錦雞兒的CkF5H基因克隆目前研究甚少。因此，克隆檸條錦雞兒的CkF5H基因并詳細(xì)分析，對(duì)于研究檸條錦雞兒中木質(zhì)素生物合成途徑方面具有深遠(yuǎn)的意義。

本研究以檸條錦雞兒為材料，通過(guò)對(duì)CkF5H基因克隆及啟動(dòng)子克隆，并對(duì)核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的一系列結(jié)構(gòu)、性質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，旨在為該基因的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

檸條錦雞兒種子采自?xún)?nèi)蒙古四子王旗；克隆載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司；CaMV 35S啟動(dòng)子、大腸桿菌感受態(tài)DH5α保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑盒及部分藥品

5′RACE試劑盒(TaKaRa，D315)、3′RACE試劑盒(TaKaRa，D314)、Genome Walking Kit (TaKaRa，D316)、植物基因組提取試劑盒(天根，DP320)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根，DP209)。

rTaqDNA聚合酶、高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，DNA Marker購(gòu)自Invitrogen。

EDTA、Tris等化學(xué)藥品購(gòu)自上海生工生物工程公司，氨芐青霉素、卡那霉素、慶大等抗生素以及瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨等購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檸條錦雞兒基因組DNA的提取 檸條錦雞兒基因組DNA的提取按照植物基因組提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.2 檸條錦雞兒總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 將生長(zhǎng)30 d的檸條錦雞兒幼苗樣品采用TRIzol法提取總RNA，提取到的RNA濃度用超微量紫外分光光度計(jì)Q5000檢測(cè)，RNA的質(zhì)量是用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選用OD260/280值為1.9～2.0，OD260/230值大于2的RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA第一鏈。

1.3.3CkF5H基因中間片段克隆 根據(jù)已經(jīng)公布的植物F5H基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F5H1-1和F5H1-3、F5H2-1和F5H2-2，檸條錦雞兒的cDNA作為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。以F5H2-1、F5H2-2擴(kuò)增第1輪；F5H1-1、F5H1-3擴(kuò)增第2輪。

反應(yīng)條件為：第1輪 ：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，30 s，48 ℃退火，30 s，72 ℃延伸，2 min，72 ℃補(bǔ)充延伸，10 min，30個(gè)循環(huán)。

第1輪PCR的產(chǎn)物稀釋100倍后作為第2輪PCR的模板，F(xiàn)5H1-1、F5H1-3進(jìn)行第2輪PCR。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，30 s，54 ℃退火，30 s，72 ℃延伸，1 min，72 ℃補(bǔ)充延伸，10 min，30個(gè)循環(huán)。

1.3.4 3′RACE擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序得到的CkF5H基因各自的中間片段設(shè)計(jì)各自所用的3′RACE引物。試驗(yàn)操作流程按照3′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 5′RACE擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序得到的CkF5H基因各自的中間片段設(shè)計(jì)各自所用的5′RACE引物。引物設(shè)計(jì)要求參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，引物序列見(jiàn)表1。試驗(yàn)操作流程按照5′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 引物序列 Tab.1 Primers sequences

1.3.6CkF5H全長(zhǎng)cDNA和gDNA擴(kuò)增 以檸條錦雞兒cDNA為模板，以F5H1-1-ov和F5H1-2-ov為特異性引物，利用高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa公司) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性，3 min；98 ℃變性，15 s；60 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，1 min 40 s；72 ℃補(bǔ)充延伸，10 min，30個(gè)循環(huán)。CkF5H基因全長(zhǎng)gDNA擴(kuò)增條件同上，但延伸時(shí)間為4 min。

1.3.7CkF5H基因啟動(dòng)子的克隆和測(cè)序 擴(kuò)增CkF5H基因啟動(dòng)子序列是利用染色體步移的方法。在CkF5H基因的gDNA序列的5′末端上設(shè)計(jì)步移引物CkF5H-SP1、F5H-SP2、F5H-SP3，引物序列見(jiàn)表1。用檸條錦雞兒gDNA作為模板，用試劑盒自帶的3種AP引物和特異性引物擴(kuò)增3輪PCR，具體試驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。選擇第3輪PCR后獲得單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。

為了獲得更長(zhǎng)的啟動(dòng)子序列，根據(jù)第1次步移獲得的啟動(dòng)子部分序列，在其5′端再次設(shè)計(jì)步移引物CkF5H-SP1-2、F5H-SP2-2和F5H-SP3-2，進(jìn)行第2次的步移。同樣選擇第3輪PCR后單一明亮條帶的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.8CkF5H生物信息學(xué)分析 用NCBI的Blast進(jìn)行CkF5H基因序列比對(duì)，分析蛋白保守區(qū)域用CDD程序，分析開(kāi)放閱讀框(ORF)用ORF finder工具，DNA序列外顯子與內(nèi)含子具體分布信息是用Spidey (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)。

利用ExPasy在線工具ProParam和ProtScale分析蛋白的各種氨基酸含量、理論分子量和等電點(diǎn)等理化參數(shù)。用Expasy中的SWISS-MODEL工具(http：//swissmodel.expasy.org/) 在線預(yù)測(cè)CkF5H蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)[21-22]。GOR4進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plan-tcare/html/) 進(jìn)行啟動(dòng)子響應(yīng)元件的分析。利用Mega 5[23-24]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，算法采用鄰接法，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

擬南芥基因從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)中獲得，其他植物基因從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條錦雞兒CkF5H基因克隆和序列分析

2.1.1CkF5H基因保守片段以及3′-RACE 和5′-RACE擴(kuò)增 根據(jù)簡(jiǎn)并引物F5H1-1、F5H1-3擴(kuò)增出1條長(zhǎng)度為581 bp的單一條帶(圖1-A)。以該序列設(shè)計(jì)RACE引物，分別得到了長(zhǎng)為910 bp的3′RACE 產(chǎn)物和627 bp的5′RACE產(chǎn)物(圖1-B、C)。將中間片段、3′-RACE 和5′-RACE序列拼接獲得1 679 bp的cDNA全長(zhǎng)。

2.1.2CkF5H基因cDNA和gDNA全長(zhǎng)克隆 以檸條錦雞兒cDNA為模板，利用特異性引物F5H1-1-ov和F5H1-2-ov進(jìn)行特異性擴(kuò)增對(duì)RACE結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)增得到CkF5H基因cDNA序列(圖1-D)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)后表明，RACE拼接得到的是CkF5H基因的ORF。以檸條錦雞兒gDNA為模板，利用特異性引物F5H1-1-ov和F5H1-2-ov進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的基因gDNA序列，gDNA全長(zhǎng)3 495 bp(圖1-E)。

圖1 CkF5H基因克隆電泳結(jié)果 Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the CkF5H gene cloned

2.2 CkF5H序列分析

通過(guò)NCBI的CDD分析顯示，屬于細(xì)胞色素P450家族，CypX超家族成員。這些都說(shuō)明克隆到的基因是檸條錦雞兒CkF5H基因，該基因具有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子，編碼520個(gè)氨基酸，其中，加粗部分為起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，大寫(xiě)字母為編碼框，小寫(xiě)字母為非編碼區(qū)域，保守序列為方框中所示。將該基因提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)HQ829862(圖2)。

2.3 CkF5H基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 對(duì)CkF5H基因推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)分析，CkF5H蛋白等電點(diǎn)為6.45，分子量為58.09 ku。不穩(wěn)定系數(shù)45.72，是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性-0.143，屬親水性蛋白。

2.3.2 蛋白理化性質(zhì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)GOR4軟件對(duì)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(豎線最長(zhǎng)表示)所占比例為39.81%，β-折疊(豎線次長(zhǎng)表示)占總數(shù)的15.96%、無(wú)規(guī)則卷曲(豎線最短表示)所占比例為44.23%(圖3)。利用SWISS-MODEL對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

用Mega 5軟件將桉樹(shù) (Eucalyptusglobulus)、苜蓿 (Medicagosativa)、油菜 (Brassicanapus)、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)、銀合歡 (Leucaenaleucocephala)、枸樹(shù) (Broussonetiapapyrifera)、楊樹(shù) (Populustrichocarpa)、喜樹(shù) (Camptothecaacuminata)、大豆 (Glycinemax) 的F5H序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，括號(hào)中是GenBank登錄號(hào)。由圖5可知，同為豆科的苜蓿、大豆、銀合歡與檸條錦雞兒CkF5H親緣關(guān)系最近，在一個(gè)分支上；其他物種F5H處于另一分支。

2.5 CkF5H啟動(dòng)子克隆及序列分析

2.5.1CkF5H基因啟動(dòng)子克隆 根據(jù)獲得的CkF5H基因gDNA序列，設(shè)計(jì)步移引物F5H-SP1、F5H-SP2、F5H-SP3，利用寶生物染色體步移試劑盒自帶引物AP1、AP2、AP3和AP4分別進(jìn)行3輪PCR，只有AP3引物擴(kuò)增時(shí)在第3輪獲得了單一的明亮產(chǎn)物(圖6-A)。經(jīng)過(guò)測(cè)序后得到ATG上游約800 bp的啟動(dòng)子序列。在此序列基礎(chǔ)上再設(shè)計(jì)步移引物F5H-SP1-2、F5H-SP2-2和F5H-SP3-2，進(jìn)行第2次的步移。第2次步移，利用引物AP2經(jīng)過(guò)3輪PCR后得到了約750 bp的單一明亮條帶(圖6-B)。將條帶回收、克隆測(cè)序得到751 bp的序列。

圖2 CkF5H基因全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列 Fig.2 Full-length nucleotide and deduced amino acid sequences of CkF5H gene

圖3 CkF5H二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The secondary structure prediction of the deduced CkF5H by GOR4

圖4 CkF5H三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of the CkF5H

圖5 CkF5H與其他物種F5Hs的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree generated by the amino acid sequences of CkF5H and other known F5Hs by Mega 5

A.第1次步移結(jié)果電泳圖；B. 第2次步移結(jié)果電泳圖;M. 1 kb Marker；1.第1輪PCR；2.第2輪PCR；3.第3輪PCR.

A.The first step results electrophoretogram;B.The second step results electrophoretogram;M.1 kb Marker；1.The first PCR；2.The second PCR；3.The third PCR.

圖6CkF5H基因啟動(dòng)子克隆
Fig.6GelelectrophoresisofthepromoterofCkF5Hcloned

2.5.2CkF5H基因啟動(dòng)子序列分析 將2次步移獲得的序列進(jìn)行拼接，得到了1 550 bp序列，該序列與CkF5H基因的起始密碼子ATG后有41 bp的重疊區(qū)域，證明獲得了該基因的啟動(dòng)子序列。經(jīng)過(guò)2次步移，得到了長(zhǎng)為1 509 bp 的上游啟動(dòng)子ATG序列。由PlantCARE和PLACE在線分析啟動(dòng)子序列，將起始密碼子ATG的A定義為+1位。該序列中存在大量的光響應(yīng)元件，如G-box、C-box、AE-box、SP1-box和TCT-motif等和晝夜節(jié)律響應(yīng)元件circadian、防御與脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、赤霉素順式作用元件TATC-box、熱響應(yīng)元件HSE(圖7)。

3 結(jié)論與討論

木質(zhì)素是維管植物細(xì)胞壁的重要組成成分，它可以影響畜牧業(yè)、造紙業(yè)的生產(chǎn)，其主要沉積在細(xì)胞次生壁中，在陸生維管植物的進(jìn)化演變過(guò)程中扮演著重要的角色[25]。在苯丙酸途徑中F5H催化不可逆的羥基化步驟，對(duì)合成紫丁香基木質(zhì)素即S-木質(zhì)素的組成成分具有很大的改造意義[26]。

本研究以檸條錦雞兒為材料，成功克隆了1個(gè)木質(zhì)素合成相關(guān)的CkF5H基因，該基因cDNA全長(zhǎng)1 679 bp，gDNA全長(zhǎng)3 495 bp，具有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子，編碼520個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)HQ829862，與其他植物的該基因序列具有同源性。使用NCBI網(wǎng)站上的BlastP工具分析發(fā)現(xiàn)，檸條錦雞兒的CkF5H基因在其進(jìn)化過(guò)程中十分保守，與家族成員的F5H保持了很高的相似度。對(duì)CkF5H基因推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)分析，CkF5H蛋白等電點(diǎn)為6.45，分子量為58.09 ku，不穩(wěn)定系數(shù)45.72，是不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性-0.143，屬親水性蛋白。

通過(guò)GOR4軟件預(yù)測(cè)檸條錦雞兒CkF5H蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明CkF5H含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，CkF5H中α-螺旋占39.81%，β-折疊占15.96%、無(wú)規(guī)則卷曲占44.23%，并采用Expasy中的SWISS-MODEL工具在線預(yù)測(cè)了檸條錦雞兒CkF5H蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)染色體步移的技術(shù)克隆了1 550 bp的啟動(dòng)子序列，對(duì)啟動(dòng)子序列上的響應(yīng)元件進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，具有晝夜節(jié)律響應(yīng)元件、防御與脅迫響應(yīng)元件、赤霉素順式作用元件和熱響應(yīng)元件等。已有的研究表明，逆境脅迫會(huì)改變木質(zhì)素的組成，赤霉素可以調(diào)節(jié)木質(zhì)素的組成[27]，而光合晝夜節(jié)律也會(huì)影響木質(zhì)素的含量和組成。

圖7 CkF5H基因啟動(dòng)子序列 Fig.7 The promoter sequence of CkF5H

而利用已報(bào)道物種中的同源基因進(jìn)行同源克隆，是一種方便、有效和經(jīng)濟(jì)的手段。本研究利用簡(jiǎn)并引物克隆了1個(gè)木質(zhì)素合成CkF5H基因，通過(guò)比對(duì)已知物種的同源基因后利用簡(jiǎn)并引物先得到基因的一段序列，然后通過(guò)RACE技術(shù)獲得基因全長(zhǎng)。在用簡(jiǎn)并引物克隆基因時(shí)，除了根據(jù)該類(lèi)基因的保守區(qū)域降低簡(jiǎn)并度外，利用巢式PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增是極為有效的手段。所以，從檸條錦雞兒中克隆關(guān)于木質(zhì)素合成酶CkF5H基因，這對(duì)從分子機(jī)制上進(jìn)一步研究檸條錦雞兒木質(zhì)素生物合成途徑有一定的幫助。

此外，通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示，CkF5H基因和其他植物的木質(zhì)素合成酶基因同源，但是由于木質(zhì)素合成過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，很多基因都是以家族形式存在，不同成員具體的生物學(xué)功能也有不同，因此，該基因是與檸條錦雞兒木質(zhì)素合成有關(guān)還是與其他抗逆、抗病機(jī)制有關(guān)，需要今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)的研究。

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