許 晴，林 森，，徐亞歐，朱江江，王 永，，林亞秋

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

藏雞是我國特有的優(yōu)良地方品種，主要產(chǎn)于青藏高原[1]。其為了適應(yīng)高原地區(qū)特殊的氣候生態(tài)環(huán)境，形成了具有抗寒、抗病、耐粗飼和優(yōu)良藥用價值等特點[2]，并且藏雞肉含有人體必需氨基酸、脂肪含量低、蛋白含量高、腿肌率高及腹脂率低等特點[3]。因此，闡明其肉質(zhì)性狀的形成機理具有重要意義。肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)可從肉的嫩度、風(fēng)味與多汁等方面調(diào)節(jié)動物肉品質(zhì)[4]，是影響肉質(zhì)的重要因素之一。因此，從IMF沉積調(diào)控機制角度入手來闡明肉質(zhì)性狀具有重要的理論及實際意義。

骨骼肌中高表達的GTP結(jié)合蛋白(GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle)屬于Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白中Rad/Gem/Kir(RGK)亞群[5]，高表達于Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌中[6]，可以調(diào)節(jié)通過Rho激酶(Rho kinase，ROK)介導(dǎo)調(diào)節(jié)電壓依賴性鈣通道(VDCC)信號傳導(dǎo)和細胞骨架重排，抑制ROK調(diào)節(jié)器[7-9]。目前，關(guān)于GEM基因的研究主要集中于小鼠和細胞系的電壓依賴性鈣通道、細胞骨架調(diào)節(jié)以及蛋白結(jié)構(gòu)等方面。直至2003年龔海霞等[10]在肥胖大鼠脂肪基因表達譜系研究中發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠和食源性肥胖大鼠的腹部脂肪組織中GEM基因存在差異表達，推測GEM基因為肥胖相關(guān)的差異表達基因，但小鼠3T3-L1細胞系中卻存在不同的報道，即GEM基因在細胞系誘導(dǎo)分化的過程中表達水平無顯著變化[11]。說明GEM基因在脂質(zhì)積累和脂肪細胞分化中的作用可能具有物種特異性，且關(guān)于GEM基因在雞脂肪沉積中的作用尚未見報道。

為了闡明GEM基因在雞肌內(nèi)脂肪沉積中的調(diào)控作用，本試驗以藏雞為研究對象，利用RT-PCR方法克隆藏雞GEM基因序列，利用生物信息學(xué)方法闡明該基因的生物學(xué)特征，利用熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)方法檢測該基因的組織和時序表達特性，進而構(gòu)建其組織和時序表達譜，并將基因表達與不同發(fā)育階段不同肌肉組織IMF含量進行相關(guān)分析，研究結(jié)果可為揭示該基因在藏雞優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成中的作用機理提供重要的數(shù)據(jù)，同時為該基因調(diào)控其他物種脂肪沉積的分子機制提供關(guān)鍵依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織樣品采集 選取1，81，119，154，210 d不同日齡健康的藏雞為試驗動物，飼養(yǎng)條件相同，且均購自成都益生康健農(nóng)業(yè)有限公司藏雞養(yǎng)殖基地(位于四川省彭州市新興鎮(zhèn)獅山村老虎崖)?，F(xiàn)場放血法屠宰后，采集各個日齡藏雞不同部位的肌肉組織并同時采集154日齡公母藏雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和皮下脂肪等組織樣品，置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

本試驗所有樣品RNA的提取均是按照TRIzol試劑盒使用說明來進行，并且均滿足如下條件：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有3條清晰條帶；紫外光分光光度計測定OD260/280值為1.8～2.0；然后將獲得的RNA按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

1.1.2 主要試劑 pMD-19T Vector、TRIzol和SYBR?Premix ExTaqTM(2×)購于TaKaRa公司；E.coliDH5α感受態(tài)細胞、2×GC-Rich PCR Master Mix及DNA膠回收試劑盒購于TIANGEN公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司；氨芐青霉素購于成都BIOSHARP公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藏雞GEM基因克隆序列 根據(jù)GenBank上原雞GEM基因序列(NM_213579.1)，利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計PCR克隆引物(表1)?？寺U增體系和條件分別為：cDNA 1 μL，10 μmol/L Sense primer 1 μL，10 μmol/L Antisense primer 1 μL，2×GC-Rich PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL；預(yù)變性95 ℃ 4 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火70 s，72 ℃延伸60 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物利用DNA膠回收試劑盒說明書進行純化，然后將其與PMD-19T載體連接2 h(16 ℃)，轉(zhuǎn)化DH5α后篩選和鑒定菌落，并將電泳結(jié)果符合預(yù)期條帶大小的菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 克隆和熒光定量PCR引物信息 Tab.1 Primers informations for reverse transcription PCR (RT-PCR) and quantitative Real-time PCR(qPCR)

注：S.正義鏈引物；A.反義鏈引物；GAPDH.甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

Note：S.Sense primer；A.Antisense primer；GAPDH.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.2.2 藏雞GEM基因序列分析 通過NCBI網(wǎng)站中ORF Finder(Open reading frame finder)在線程序?qū)ふ也仉uGEM序列開放閱讀框；蛋白質(zhì)序列相似性比對由DNAMAN Version 5.2.10軟件分析，NJ系統(tǒng)進化樹由MEGA 7.0軟件構(gòu)建；蛋白基本理化性質(zhì)(氨基酸組成、分子量、等電點、親水性等)由ExPASy ProtParam推導(dǎo)；磷酸化位點、O糖基化位點和N糖基化位點分別由NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0預(yù)測；亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和信號肽分析分別利用PSORT II、TMHMM和SignaIP 4.1 Server軟件來進行；蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)分別采用Hopfield和Swiss-model預(yù)測分析；應(yīng)用Conserved Domains預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 藏雞GEM基因組織表達差異分析 根據(jù)前面獲得的藏雞GEM基因序列設(shè)計特異引物(表1)用于qPCR的檢測。qPCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL，Sense primer(10 μmol/L)1 μL，Antisense primer(10 μmol/L)1 μL ，SYBR?Premix ExTaqTM

(2×)PCR 10 μL，補充ddH2O至20 μL。qPCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min(預(yù)變性)；95 ℃ 10 s(變性)，60 ℃ 10 s(退火)，72 ℃ 15 s(延伸)，38個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，以準(zhǔn)確矯正表達水平，同時每個組織樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 藏雞GEM基因在胸肌和腿肌中的時序表達差異 選取不同生長發(fā)育(1，81，119，154，210 d)藏雞公母雞各8只，分別提取胸肌和腿肌總RNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，利用qPCR檢測GEM基因的表達水平。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.3(退火溫度為62 ℃)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 依據(jù)qPCR所測得的Ct(GEM)和Ct(GAPDH)計算目的基因的相對表達量，Ct是qPCR反應(yīng)中擴增產(chǎn)物的熒光信號強度達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行均一化處理，其中ΔCt=Ct(GEM)-Ct(GAPDH)、ΔΔCT= ΔCt(樣品組)-ΔCt(對照組)。利用SPSS 18.0軟件中一般線性模型(單因素)進行顯著性檢驗，采用雙變量相關(guān)對GEMmRNA表達水平與IMF含量進行相關(guān)性分析。P<0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏雞GEM基因的克隆

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，克隆產(chǎn)物為條帶單一的特異片段，且與預(yù)期目的產(chǎn)物大小相符。藏雞GEM基因全長為940 bp，其中，ORF長度為894 bp，5′ UTR序列24 bp和3′ UTR序列22 bp，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TAA，共編碼297個氨基酸。對其堿基序列組成分析發(fā)現(xiàn)，A=28.6%，T=19.6%，C=23.3%，G=28.5%。C+G=51.8%，A+T=48.2%，說明該基因CDS區(qū)的DNA雙鏈較穩(wěn)定。提交至GenBank獲得登錄號為KY747399。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，藏雞GEM基因與原雞(NP_998744.1)核苷酸序列相似性為99.33%，共檢測5個堿基突變，c.347A>T(p.Glu115Asp)、c.566G>T(p.Leu188Phe)、c.598A>G(p.His199Arg)、c.875T>G(p.His291Asp)和c.876G>T(p.Gln292Tyr)。藏雞GEM氨基酸序列與原雞、綠頭鴨、人和小鼠的相似性分別為98.32%，97.32%，83.50%和83.84%(圖1)。

2.2 藏雞GEM基因序列分析

藏雞GEM蛋白分子式為C1481H2388N444O456S14，預(yù)測分析其分子質(zhì)量為34.16 ku，理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)和親水性總平均值分別為9.01，81.35，-0.601，說明該蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白。藏雞GEM蛋白所編碼的297個氨基酸中Ser(10.4%)、Arg(8.8%)和Val(8.4%)頻率較高，同時帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為29，多于帶負電荷的氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu=41)，因此整體帶正電荷。預(yù)測結(jié)果表明，藏雞GEM蛋白無信號肽序列及跨膜結(jié)構(gòu)域，主要在線粒體(47.8%)和細胞核(43.5%)中發(fā)揮生物學(xué)作用，其次在過氧化物酶體(8.7%)中發(fā)揮生物學(xué)作用；該蛋白所具有的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點分別為21，6，6個，存在2個N-糖基化位點(第5位對應(yīng)氨基酸殘基N-糖基化修飾概率為0.744 0，第192位對應(yīng)氨基酸殘基N-糖基化修飾概率為0.561 3)，無O-糖基化位點。GEM二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲占41.08%，α-螺旋占29.97%，延伸鏈占28.96%，無β-折疊。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖2)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示(圖3)，藏雞GEM蛋白具有RGK家族的典型結(jié)構(gòu)域以及GTP/Mg2+結(jié)合位點，同時具有小G蛋白共有的SwitchⅠ、Switch Ⅱ和G1 BOX、G2 BOX、G3 BOX、G4 BOX、G5 BOX。

GenBank登錄號：藏雞.KY747399；原雞.NP_998744.1；綠頭鴨.XP_005030168.1；人.NP_005252.1；小鼠.NP_034406.2。GenBank accession number：Tibetan chicken.KY747399；Gallus gallus.NP_998744.1；Anas platyrhynchos. XP_005030168.1； Homo sapiens.NP_005252.1；Mus musculus.NP_034406.2.

圖2 GEM三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Putativetertiary structure prediction of GEM

圖3 藏雞GEM推測的氨基酸序列生物學(xué)功能預(yù)測 Fig.3 Prediction of biological function of the deduced amino acid sequence of Tibetan chicken GEM

2.3 物種間GEM氨基酸序列同源性比較與系統(tǒng)進化樹分析

利用NCBI中Blast(Basic local alignment search tool)程序?qū)Σ仉uGEM氨基酸序列與原雞(NP_998744.1)、綠頭鴨(XP_005030168.1)、貓(XP_004000024.1)、人(NP_005252.1)、豬(XP_001927011.3)、大鼠(NP_034406.2)、牛(NP_001077201.2)、小鼠(NP_034406.2)、猴(XP_001087849.1)、綿羊(XP_004012065.1)、狗(XP_013964797.1)和斑馬魚(NP_001039314.1)的氨基酸序列進行分析，其同源性依次為100%，98%，98%，84%，84%，84%，84%，84%，84%，83%，85%，75%，53%。同時利用以上物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)，結(jié)果表明，該基因在進化上高度保守，藏雞GEM與家禽屬同一分支，親緣關(guān)系最近。

圖4 不同物種間GEM氨基酸的進化樹 Fig.4 Phylogenetic tree of GEM of various species

2.4 藏雞GEM基因的組織表達譜

qPCR檢測GEM基因在154日齡公雞和母雞不同組織的表達情況(圖5)，以GADPH為參照基因，以心組織的表達水平作為對照，結(jié)果顯示，該基因普遍表達于公母藏雞的多個組織，但表達模式具有性別差異。GEM基因在藏雞的肺組織中表達水平最高，極顯著高于其他各個組織(P<0.01)，在公藏雞的皮下脂肪中也存在較高水平的表達(P<0.01)，在母藏雞的脾中也存在較高的表達水平(P<0.01)。

以心組織的表達水平為對照，GAPDH作為內(nèi)參；1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.皮下脂肪；7.胸?。?.腿??；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表6同。The expression level of the heart tissue was used as control，GAPDH was used as internal reference；1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Subcutaneous fat；7.Breast muscle；8.Thigh muscle；Different superscript lowercase and capital letters respectively showed extremely significant difference(P<0.05) and significant difference(P<0.01) . The same as Tab.6.

2.5 藏雞GEM基因的時序表達譜

本試驗依據(jù)物種特點、脂肪發(fā)育的特點和西南民族大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室前期試驗選擇1～210日齡藏雞的胸肌和腿肌[3]，檢測GEM基因的時序表達豐度(圖6)，結(jié)果表明，該基因在藏雞胸肌表達水平隨日齡的增長而逐漸降低，在119，154，210日齡時表達水平較低，均極顯著低于前2個時期的表達水平(P<0.01)；在1，81日齡時該基因的表達趨勢存在性別差異，1日齡母雞胸肌中表達量極顯著高于81日齡的表達量(P<0.01)，但在公藏雞胸肌中差異不顯著(P>0.05)。在藏雞腿肌中的表達水平呈先上升后下降趨勢，在119日齡公、母藏雞胸肌中GEM表達水平顯著高于其他日齡(P<0.01)，不存在性別差異。

圖6 藏雞GEM基因在不同發(fā)育階段胸肌和腿肌中的相對表達水平 Fig.6 GEM gene relative expression in breast muscle and thigh muscle of Tibetan chicken at different ages

2.6 藏雞不同肌肉組織GEM mRNA表達水平與IMF含量的相關(guān)性分析

本試驗中所用的不同發(fā)育階段IMF含量數(shù)據(jù)為本實驗室前期測定[12-13]，藏雞生長發(fā)育不同階段胸肌和腿肌GEM基因表達水平與其IMF含量相關(guān)性分析結(jié)果表明，該基因的表達水平與相應(yīng)的IMF含量呈不同程度的相關(guān)，且性別不同相關(guān)性相反(表2)。在81～210日齡藏雞胸肌及81～119日齡藏雞腿肌中，GEMmRNA相對表達水平與其IMF含量的顯著性無性別差異，119～210日齡藏雞腿肌GEMmRNA相對表達水平與IMF含量的顯著性存在性別差異，且在公藏雞上相關(guān)性達到顯著水平(r=0.414，P<0.05)。

表2 藏雞GEM mRNA表達水平與IMF含量的相關(guān)性分析Tab.2 The correlation analysis GEM mRNA expression level and IMF content in Tibetan chickens

注：*.差異顯著(P<0.05)。

Note：*.Remarkable difference (P<0.05).

3 討論與結(jié)論

GEM基因序列首次報道于1994年，該基因由有絲分裂原誘導(dǎo)的人類外周血T細胞克隆得到[6]，隨后受到學(xué)者廣泛關(guān)注。GEM發(fā)揮功能主要是通過其蛋白不同結(jié)構(gòu)位點介導(dǎo)來實現(xiàn)的[14]，比如：GEM通過改變ROKβ的底物特異性(而不是阻斷其催化活性)來抑制Rho激酶(ROK)介導(dǎo)的細胞骨架重排[9，15]；GEM通過抑制生長激素分泌(通過L型鈣通道的鈣離子流刺激引起的)來抑制鈣離子電壓門控通道活性，并且該功能依賴于GTP和鈣調(diào)素與GEM蛋白結(jié)合[16-17]。關(guān)于GEM在雞脂肪沉積中的作用及機制則尚不清楚。

本研究克隆得到藏雞GEM基因序列940 bp的基因序列，共編碼297個氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，藏雞GEM基因具有RGK家族的典型結(jié)構(gòu)域和GTP/Mg2+結(jié)合位點，同時具有小G蛋白共有的SwitchⅠ、SwitchⅡ和G1-5 BOX[18]。與原雞相比，藏雞GEM核苷酸序列具有5個堿基突變，均為錯義突變。預(yù)測結(jié)果顯示，藏雞GEM蛋白具有33個磷酸化位點和2個糖基化位點，因磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式[19 -20]，故推測這些位點可能對調(diào)節(jié)藏雞GEM蛋白功能起重要作用。氨基酸序列相似性比對分析指出，藏雞GEM基因與原雞、綠頭鴨具有較高的同源性，同時通過構(gòu)建進化樹也顯示出該基因序列在禽類動物中高度保守。

為了進一步闡明GEM基因在藏雞脂肪沉積中的作用，本試驗在獲得該序列的基礎(chǔ)上利用qPCR技術(shù)檢測其在藏雞各組織中的表達情況，獲得其組織表達譜。結(jié)果顯示，GEM基因在藏雞多種組織中均有表達，且在肺組織中具有最高的表達水平，其次為皮下脂肪和脾組織，可能與這些組織是禽類脂質(zhì)代謝的主要場所有關(guān)。這與其他學(xué)者在大鼠中的報道存在不同之處，如Maguire等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胸腺、脾臟、腎臟、肺和睪丸組織中檢測到最豐富的GEMmRNA，但在心臟、大腦、肝臟和骨骼肌細胞中GEMmRNA相對較少或沒有轉(zhuǎn)錄。原因可能是由于GEM基因的組織表達特性具有物種特異性。時序表達結(jié)果顯示，在藏雞胸肌中GEM基因表達量隨日齡增加逐漸減少，推測該基因主要在幼齡藏雞的胸肌中發(fā)揮重要作用；而該基因在腿肌中的表達水平隨日齡增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且在119日齡時達到峰值，與GEM基因在胸肌中的表達模式不同，提示該基因在不同部位肌肉組織發(fā)育過程中的分子機制可能存在差異。但在藏雞同一部位肌肉組織中，該基因表達模式則不存在性別差異。由上可知，不同性別、年齡和組織部位均會影響GEM基因的表達。然而，GEM基因在時空上的廣泛表達是否預(yù)示著其在脂代謝過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，關(guān)于該基因功能鑒定及其作用機制有待進一步試驗研究。在該基因的大量研究報道中并未涉及其與IMF沉積的關(guān)系。因此，為了揭示該基因與IMF沉積的關(guān)系，本研究對藏雞不同發(fā)育階段胸肌和腿肌中GEM基因表達水平與IMF含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，GEM基因在不同日齡不同部位的肌肉組織中的表達水平與相應(yīng)IMF含量具有一定的相關(guān)性，并且存在性別差異，且GEM基因與藏雞腿肌的IMF存在顯著相關(guān)，推測可以作為藏雞脂肪沉積的候選基因。本試驗研究結(jié)果為在大鼠中的研究提供佐證[10]，但該基因如何調(diào)控脂肪細胞分化、脂肪沉積、脂質(zhì)代謝則需要進一步研究，這也是本實驗室下一步的主要研究內(nèi)容。

本試驗克隆得到藏雞GEM基因CDS全長940 bp，編碼297個氨基酸。組織表達譜顯示，GEM基因在藏雞肺組織中存在較高水平的表達；時序表達譜顯示，在藏雞發(fā)育不同階段的胸肌和腿肌中，GEM的表達模式具有性別差異，GEM基因在不同發(fā)育階段胸肌及腿肌中的表達量與IMF含量呈不同程度相關(guān)且具有性別差異。本試驗研究結(jié)果為進一步研究GEM基因在藏雞脂質(zhì)代謝中的作用提供了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

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