，

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)是半揮發(fā)性碳氫化合物，是重要的環(huán)境和食品污染物，PAHs主要來源于含碳燃料如木材、煤、柴油和煙草的不完全燃燒[1]，迄今已發(fā)現(xiàn)有200多種PAHs，其中有相當部分具有致癌性[2].PAHs廣泛分布于環(huán)境中，并且能夠直接通過呼吸道、消化道和皮膚等被人體吸收，或者通過食物鏈在人和動物體內(nèi)堆積，這大大增加了人類和野生動物暴露的潛在風險[3].PAHs具有持久性[4]，能夠長時間停留在環(huán)境中，在不同的介質(zhì)間相互遷移轉化[5].芳香烴受體(AhR)是一種配體激活轉錄因子，可介導多環(huán)芳烴類化合物的毒性反應(包括致癌性).AhR的配體十分廣泛，包括血紅素、色氨酸和花生四烯酸等內(nèi)源性配體和PAHs、多氯聯(lián)苯(PCBs)和鹵代二噁英等外源性配體[6].而PAHs作為芳烴受體(AhR)的外源配體，能夠競爭性地結合AhR并識別其同源的DNA結合位點即外源性生物反應元件(XRE).XRE位于AhR-reponsive基因的調(diào)節(jié)區(qū)，它們的結合能夠導致下游靶基因如細胞色素P450家族1亞科A成員1(cyp1a1)和細胞色素P450家族1亞科B成員1(cyp1b1)轉錄的激活[7-8].PAHs能夠引起多種人類健康風險問題，例如癌癥、基因突變和神經(jīng)毒性等[9].劉紅陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)Pb和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)聯(lián)合暴露可以誘導斑馬魚胚胎中白細胞介素-1β(IL-1β)和C3B基因表達水平上升，Lyz基因表達水平下降，說明Pb和DBP聯(lián)合暴露可通過影響斑馬魚胚胎免疫相關基因的表達，對斑馬魚胚胎產(chǎn)生免疫毒性，雖然有這些進展，但是對描述PAHs在小鼠中引起炎癥反應的機制的研究還是有限的.

3-甲基膽蒽(3-MC)屬于二噁英類化合物，是高度脂溶性的環(huán)境污染物，可由土壤、水或飼料等進入食物鏈，有肝毒性、免疫毒性、生殖毒性和發(fā)育毒性等毒性[11].CH-223191是一種有效的特異性的芳烴受體(AhR)拮抗劑，它能有效抑制四氯二苯并-P-二噁英(Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)介導的核易位和AhR與DNA結合，并抑制TCDD誘導的熒光素酶活性.以前大量的研究表明，PAHs暴露可以通過激活AhR[12]介導腫瘤相關基因的表達，一些報道也顯示PAHs能夠誘導不同模式生物的免疫毒性，但是否與AhR的參與與介導相關仍是未知.

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

在注射之前，實驗使用的3-MC(CAS號56-49-5，純度99.9%)購自Supelco(Bellefonte，USA)并溶解于玉米油(Vako，Japan)，CH223191(CAS號301326-22-7，純度99.9%)購自Sigma公司.

1.2 動物和實驗設計

從中國國家實驗動物資源中心(中國上海)購買總共126只5周齡的青春期雄性ICR小鼠.將小鼠保存在實驗室動物房中(在籠子水平下用200 lux條帶光照明，光周期為12 h光照/黑暗和(22±1) ℃的溫度)1周，然后進行實驗.將小鼠隨機分配到兩個獨立實驗.

實驗13組小鼠(每組n=21)每隔1 d以0，5 mg/kg或20 mg/kg體重劑量進行腹腔注射3-MC. 然后，在1 d(1次注射)，3 d(2次注射)，7 d(4次注射)后處死各組中的7只處理的小鼠，迅速收集肝臟和血液等組織用于進一步使用.

實驗2將小鼠隨機分為3組(每組n=21)，這些小鼠每隔1 d接受0，5 mg/kg或20 mg/kg體重劑量的3-MC腹腔注射，同時每天接受10 mg/kg體重劑量的CH223191的腹腔注射.在1，3，7 d處理后，迅速收集肝臟、血液以及其他組織用于進一步分析.

在2個實驗中，暴露期間自由飲食、飲水.麻醉后處死所有小鼠，并進行各種努力以使每個實驗中的動物痛苦最小化，所有實驗均根據(jù)毒理學動物使用指導原則進行.

1.3 基因表達分析

使用Trizol試劑(Takara biochemicals，Dalian，China)從小鼠肝臟中分離總RNA，并使用逆轉錄酶試劑盒(Toyobo，Tokyo，Japan)合成相應的cDNA.使用Eppendorf Mastercycler ep Realplex2(Wesseling-Berzdorf，Germany)進行實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR).使用SYBR Green系統(tǒng)(Toyobo，Tokyo，Japan)檢測GAPDH，AhR，Cyp1a1，Cyp1b1，腫瘤蛋白P53(P53)，MYC原癌基因(Cmyc)，Ras癌基因(Ras)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素6(IL6)，IL1β和γ-干擾素(IFN-γ)的轉錄，上述基因引物的序列參考筆者團隊以前的報道[13]，GAPDH轉錄物用作管家基因.PCR反應程序如下：95 ℃預變性1 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min共設置40個循環(huán).在收集數(shù)據(jù)之后，分析不同處理組中每個基因的表達的相對表達量.

1.4 肝臟組織中炎癥因子水平的測定

取約50 mg的肝臟組織，將組織加入適量的生理鹽水搗碎，3 kr/min離心10 min取上清備用.使用相應的小鼠ELISA試劑盒(Multi sciences，China)，根據(jù)制造商的說明書進行操作，測定炎癥因子TNF-α和IL1β的水平.ELISA測定在96孔微孔板中進行，并在酶標儀(Power wave XS，Bio-TEK，USA)上測量.

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過方差分析(ANOVA)評估組間差異，隨后使用SPSS 13.0軟件(Chicago，USA)進行Fisher’s post-hoc檢驗.值表示為平均值±SEM.p<0.05的差異被認為是顯著的.

2 實驗結果與分析

2.1 3-MC和AhR抑制劑CH223191(CH)暴露小鼠對體重、相對肝臟重量的影響

在5，20 mg/kg體重劑量下，小鼠暴露于3-MC1，3，7 d后體重和相對肝重相比于對照組并沒有顯著的差異.3-MC和CH223191聯(lián)合暴露1，3，7 d后，體重和相對肝重也沒有表現(xiàn)明顯差異(圖1).這些數(shù)據(jù)說明短期急性3-MC暴露不會顯著影響小鼠體重和相對肝重量.

A—Con；B—3-MC(5 mg/kg)；C—3-MC(20 mg/kg)；D—3-MC(5 mg/kg)+CH(10 mg/kg)；E—3-MC(20 mg/kg)+CH(10 mg/kg)圖1 3-MC和CH223191暴露對小鼠體重、相對肝臟重量的影響Fig.1 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on body weights and liver weights

2.2 3-MC和CH223191暴露對肝臟中AhR及下游基因表達的影響

PAHs毒性的產(chǎn)生主要是通過AhR介導的途徑來誘導不同靶基因的轉錄，已有的研究結果顯示，免疫系統(tǒng)已經(jīng)證明可以為AhR介導的轉錄調(diào)節(jié)提供敏感靶標.在5和20 mg/kg劑量下，暴露于3-MC 1，3，7 d后，肝臟中AhR的mRNA水平顯著的增加.同時AhR的兩個主要靶基因(cyp1a1和cyp1b1)的mRNA水平也顯著增加，并且在所有三個時間點，3-MC暴露激活cyp1a1和cyp1b1 mRNA水平均呈現(xiàn)劑量依賴性增長.CH223191是AhR特異性的拮抗劑，能夠有效抑制TCDD誘導的AhR依賴性轉錄.此外，CH223191阻止TCDD與AhR的結合，并抑制TCDD介導的核易位和AhR的DNA結合[14].本實驗中，暴露于3-MC的同時給予10 mg/kg體重劑量的CH223191處理，在1 d后AhR，cyp1a1和cyp1b1基因相比于單獨的3-MC暴露并沒有出現(xiàn)明顯的差異，而在3，7 d的時候，AhR，cyp1a1和cyp1b1基因的mRNA水平雖然相比于對照組有明顯的升高，但是相比于單獨的3-MC暴露出現(xiàn)明顯的下調(diào)，并且在處理3 d時表現(xiàn)得尤為明顯(圖2).說明AhR介導的轉錄途徑在CH223191處理后受到一定抑制，研究也證明了CH223191可以阻止外源性配體與AhR的結合，抑制靶基因cyp1a1和cyp1b1的表達.數(shù)據(jù)說明3-MC作為外源配體可以激活AhR通路，而通過拮抗劑處理后，AhR通路在一定程度上受到了抑制.

圖2 3-MC和CH223191暴露小鼠對肝臟中AhR調(diào)節(jié)基因mRNA表達水平的影響Fig.2 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of AhR regulates genes in the liver

2.3 3-MC和CH223191暴露對肝組織中相關癌基因表達的影響

近年來，用不同實驗模型來研究環(huán)境污染物對免疫系統(tǒng)的影響越來越受到人們的關注[15-17].例如報道稱人類直腸組織中PAHs的含量與直腸癌的發(fā)生有一定的相關性[18].苯并芘除了能夠誘導胃癌和皮膚癌外，還可引起食管癌、上呼吸道癌和白血病，并可通過母體使胎兒致畸.PAHs是AhR的激動劑，其可以被內(nèi)源性配體激活并且在免疫應答[19]、分化[20]和腫瘤促進中起重要作用[21].本實驗中，在不同劑量的3-MC暴露組，暴露1 d后，所有癌基因的表達量相比于對照組沒有顯著的變化.暴露于3-MC 3，7 d后，P53和Cmyc的基因表達量出現(xiàn)明顯的上調(diào)，Ras則沒有明顯的改變.實驗結果也證明3-MC暴露小鼠，肝臟內(nèi)部分癌癥相關基因的表達量出現(xiàn)明顯上調(diào)，3-MC暴露可能誘發(fā)腫瘤.3-MC和CH223191聯(lián)合暴露3 d后，P53的基因表達量相比于單獨的3-MC暴露出現(xiàn)明顯的下調(diào)，而Cmyc，Ras的mRNA表達水平與對照組相比較沒有明顯的差異.聯(lián)合暴露7 d后，P53基因的表達量與對照組相比有明顯的升高，與單獨的3-MC暴露相比則也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，Cmyc和Ras基因的相對表達量與單獨的3-MC暴露組相比則沒有顯著差異(圖3).數(shù)據(jù)說明加入AhR拮抗劑處理后，一定程度上改變了3-MC誘導引起免疫毒性和誘導腫瘤的發(fā)生.

圖3 3-MC和CH223191暴露小鼠對肝臟中癌癥相關基因的mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of Cancer-related genes in the liver

2.4 3-MC，CH223191暴露對肝臟中炎癥相關基因轉錄的影響

在單獨的3-MC暴露組，處理1 d時炎癥相關基因的mRNA水平顯示有一定程度上的降低，而在3-MC和CH223191聯(lián)合暴露1 d后，炎癥相關基因的TNF-α，IL-6在肝臟中的mRNA水平出現(xiàn)明顯的升高.此外，在3-MC分別暴露3，7 d后，相比于對照組TNF-α，IL-6和IL-1β都有明顯的升高(圖4).而在3-MC暴露組經(jīng)過10 mg/kg體重劑量的CH223191處理后，相比于沒有經(jīng)過CH223191處理的3-MC暴露組的炎癥基因的表達量則出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，并且這種下調(diào)在3 d的時候表現(xiàn)得尤為顯著.數(shù)據(jù)說明，在3-MC暴露組經(jīng)過AhR拮抗劑處理后，炎癥基因的表達受到了明顯的影響.而在本實驗中也發(fā)現(xiàn)P53在拮抗劑處理后出現(xiàn)一定的下調(diào)，P53能抑制細胞因子IL-6的轉錄[22]，也能直接結合在PTGS2的啟動子上從而抑制COX2的表達，從而影響炎癥反應.大量的實驗數(shù)據(jù)表明：P53與IL-6等炎癥因子之間存在一定的關系，P53能夠參與調(diào)控炎癥和免疫應答.筆者測定了癌癥相關基因P53，Cmyc，Ras的mRNA表達水平，單獨的3-MC暴露3，7 d后，肝臟中P53，Cmyc的表達量都有明顯的升高，與之相應的是其炎癥基因TNF-α和IL-6的表達量也有一定的升高.在CH223191處理后，P53的表達量相比于單獨的3-MC暴露組相比，出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，其炎癥基因IL-6，TNF-α的表達量也隨之有明顯的下調(diào)(圖3，4).例如，Rayanade[23]等報道在肺癌小鼠模型中，IL-6缺失加速腫瘤發(fā)生，但延遲腫瘤進展并延長存活時間，并且這些影響可以通過P53刪除來減緩.總之，研究說明CH-223191有效地阻止了3-MC引起的誘導細胞AhR調(diào)節(jié)基因和P53的表達，進而影響其對免疫系統(tǒng)的影響，從而改變多環(huán)芳烴暴露引發(fā)的炎癥發(fā)現(xiàn)和誘發(fā)腫瘤的可能性.

圖4 3-MC和CH223191暴露小鼠對肝臟中炎癥相關基因的mRNA表達水平的影響Fig.4 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of IL-6，IL-1β and IFN-γin the liver

2.5 3-MC和CH223191暴露3 d后對肝臟中炎癥因子水平的影響

分別用5，20mg/kg的體重劑量3-MC暴露小鼠3 d后，肝臟中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平明顯升高，而在5，20 mg/kg的3-MC，10 mg/kg CH223191聯(lián)合暴露3 d后，炎癥因子的表達相比于單獨的3-MC暴露都出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，如圖5所示.

4 結 論

研究表明：3-MC暴露可以激活AhR介導的轉錄途徑，通過增強一些細胞因子的轉錄水平和改變炎癥反應來產(chǎn)生免疫毒性等，在經(jīng)過AhR抑制劑CH223191處理后有效地阻止了3-MC引起的誘導細胞AhR調(diào)節(jié)基因和P53的表達，進而影響其對免疫系統(tǒng)的影響.AhR介導的轉錄途徑受到抑制，3-MC誘導引起的的炎癥反應和肝毒性也受到一定的抑制.盡管研究的數(shù)據(jù)還不能詳細說明3-MC誘導的免疫毒性的機制，但為改善PAHs暴露引起的炎癥反應提供了一定的思路.

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