， ，，，，，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310014；2.浙江海博食品有限公司，浙江 舟山 316100)

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)，是一種陰離子酸性粘多糖，由β-(1→3)-D-N乙酰氨基葡萄糖與β-(1→4)-D-葡萄糖醛酸雙糖單位重復(fù)連接而成[1-2].透明質(zhì)酸具有獨(dú)特的保濕性和生物親和性，并具有多種生物功能[3]，在化妝品、醫(yī)藥新型材料等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用.目前透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝主要有生物組織提取法和鏈球菌發(fā)酵法[4-5].以雞冠和人類臍帶等陸生動(dòng)物所提取的透明質(zhì)酸存在禽流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒等生物污染風(fēng)險(xiǎn).而金槍魚眼來源的透明質(zhì)酸因種屬差異，具有更高生物安全性.目前有許多對(duì)金槍魚廢棄內(nèi)臟、魚骨進(jìn)行綜合利用的研究[6-7]，但是金槍魚頭因無法利用造成大量浪費(fèi)和污染.因此以金槍魚眼作為原料提取透明質(zhì)酸，降低了透明質(zhì)酸的提取成本，可以為我國低附加值的金槍魚產(chǎn)業(yè)提供更多的選擇.傳統(tǒng)生物組織提取法常使用乙醇沉淀法[8]、季銨鹽絡(luò)合法[9]和柱層析法[10]純化透明質(zhì)酸，在國內(nèi)外都有廣泛應(yīng)用，但是對(duì)季銨鹽絡(luò)合法純化透明質(zhì)酸并沒有做深入研究優(yōu)化.本實(shí)驗(yàn)首次使用金槍魚眼為原料，利用季銨鹽在不同鹽離子濃度下與HA絡(luò)合、解離的性質(zhì)分離多糖，使用十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride monohydrate，CPC)純化透明質(zhì)酸.本實(shí)驗(yàn)對(duì)魚眼透明質(zhì)酸進(jìn)行丙酮脫脂、酶解、Savage法和乙醇沉淀法等處理，并且優(yōu)化了CPC絡(luò)合條件，所得透明質(zhì)酸與離子交換柱法[10-11]比較，得到了一條合理的工藝生產(chǎn)路線，為金槍魚眼透明質(zhì)酸提取利用提供了應(yīng)用基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮金槍魚眼(浙江海博食品有限公司)；CPC、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、四硼酸鈉、牛血清蛋白、胰蛋白酶(生工生物工程(上海)有限公司)；DEAE-纖維素52(Whatman)；透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；濃硫酸使用優(yōu)級(jí)純；95%乙醇、無水乙醇、氯仿、丙酮和正丁醇均使用分析純.

UV2600A紫外分光光度計(jì)(優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司)；HJ-3恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)；賽默飛Sorvall ST 16R高速離心機(jī)(杭州寶誠生物技術(shù)有限公司)；凍干機(jī)(沈陽北冰洋食品工程有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚眼透明質(zhì)酸提取工藝流程

新鮮魚眼采用丙酮脫脂、胰蛋白酶水解法、Savage法、乙醇沉淀法和CPC法等手段提取純化金槍魚眼透明質(zhì)酸，具體操作過程如圖1所示.

圖1 金槍魚眼透明質(zhì)酸提取純化路線圖Fig.1 Extraction and purification of hyaluronic acid

1.2.2 透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

根據(jù)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)計(jì)算可得，每100 mg透明質(zhì)酸水解可產(chǎn)生48.38 mg.使用葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線.采用Bitter等[12]咔唑法測(cè)定葡萄糖醛酸含量，乘以系數(shù)2.07可得樣品中HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù).葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.010 24C+0.002 24，R2=0.999 74.

1.2.3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

使用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線.采用Bradford[13]法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù).蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.006 2C-0.004 4，R2=0.999 5.

1.2.4 十六烷基氯化吡啶法純化透明質(zhì)酸

使用500 mL低濃度NaCl溶液溶解透明質(zhì)酸沉淀，抽濾后作為母液，加入一定量的1% CPC溶液攪拌反應(yīng).沉淀完全后，所得沉淀使用高濃度NaCl溶液解離，得解離液，再次抽濾后使用三倍體積95%乙醇醇沉，沉淀冷凍干燥.測(cè)定純化后樣品HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，檢測(cè)母液與解離液除蛋白率，透明質(zhì)酸回收率.

1.2.5 DEAE-纖維素層析柱純化透明質(zhì)酸

裝填DEAE-纖維素52層析柱，柱體積約為180 mL.將透明質(zhì)酸粗品20 mg使用5 mL蒸餾水溶解，過離子交換柱.使用蒸餾水沖洗200 mL，后續(xù)再使用1.0 mol/mL NaCl溶液作為洗脫劑，沖洗400 mL，流速0.6 mL/min，每5 mL收集一管，采用上述硫酸咔唑法檢測(cè)HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)吸光度繪制洗脫曲線.將含HA較高的洗脫液使用乙醇沉淀，沉淀冷凍干燥，得到純化后的的透明質(zhì)酸.

1.2.6 透明質(zhì)酸的紅外光譜分析

取透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品，純化后透明質(zhì)酸樣品各1～2 mg，使用溴化鉀壓片，在400～4 000 cm-1下掃描.

2 結(jié)果與討論

2.1 魚眼透明質(zhì)酸的提取

取新鮮魚眼4 314 g，采用丙酮脫脂，烘干粉碎的魚眼丙酮粉210 g.取25 g魚眼丙酮粉使用胰蛋白酶水解法、Savage法和乙醇沉淀法初步提取并分離所含透明質(zhì)酸.胰蛋白酶水解條件為溫度45 ℃，時(shí)間2 h，pH=8.5，V(水提液)∶V(胰蛋白液)=250∶1，胰蛋白液質(zhì)量濃度為1 g/L.所提透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.1%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.1%，得率為0.013%.此步驟為原料制備，即操作流程圖1中乙醇沉淀后產(chǎn)物.將所得透明質(zhì)酸配成0.1%的HA溶液500 mL作為后續(xù)CPC法工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的樣品液.

2.2 CPC法純化透明質(zhì)酸的優(yōu)化

2.2.1 HA-CPC絡(luò)合時(shí)間對(duì)HA回收率的影響

考察HA-CPC絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間對(duì)HA回收率的影響，如圖2所示.HA溶液加入過量1% CPC溶液反應(yīng)，每隔30 min取樣1 mL，離心后測(cè)清液HA吸光度，計(jì)算出HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計(jì)算出HA回收率.

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)HA回收率的影響Fig.2 Effects of extraction time on percent recovery of HA

從圖2可知：透明質(zhì)酸與十六烷基氯化吡啶在低鹽環(huán)境下形成絡(luò)合物，在60 min內(nèi)即可反應(yīng)完全，HA回收率可達(dá)97.2%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長，HA回收率緩慢降低，這可能是HA-CPC在溶液中部分解離造成的.同時(shí)，過量的CPC也無法回收溶液中殘留的HA，因此HA-CPC絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間控制在60 min為宜.

2.2.2 CPC使用量對(duì)HA回收率和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

使用約0.1% HA溶液500 mL樣品液，加入一定量的NaCl，再分別加入不同體積的1% CPC溶液，反應(yīng)60 min后，解離，醇沉，檢測(cè)并計(jì)算出HA回收率，HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)指標(biāo)，如圖3所示.

圖3 1% CPC使用量對(duì)HA回收率、HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)品蛋白的影響Fig.3 Effects of 1% CPC dosage on percent recovery of HA，HA purity and protein content

從圖3可知：HA回收率隨著CPC使用量增加而上升，達(dá)到95.2%左右，隨后便保持穩(wěn)定.但是蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有了較大提高，成品HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)了比較明顯的下降，這可能是由于過量的CPC會(huì)與溶液中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)絡(luò)合，產(chǎn)生沉淀，并且在高鹽環(huán)境解離的時(shí)候破壞了這種絡(luò)合條件，再次游離出來造成的.同時(shí)，HA-CPC絡(luò)合物在易粘附在杯壁、杯底，部分蛋白也會(huì)粘附在上面，故造成蛋白的增加.另外，推測(cè)CPC與HA并不是一對(duì)一絡(luò)合的，過量的CPC會(huì)造成聚團(tuán)沉淀現(xiàn)象，同時(shí)在解離過程中游離出更多的CPC，對(duì)HA產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)造成較大影響，因此CPC使用量在HA回收率不再增加時(shí)即可，本實(shí)驗(yàn)中500 mL約0.1% HA溶液使用40 mL 1.0% CPC為宜，即V(0.1% HA溶液)∶V(1.0% CPC溶液)=25∶2.

2.2.3 酶解法、醇沉法和CPC法除蛋白效率的比較

魚眼透明質(zhì)酸水提液分別使用酶解法、醇沉法和CPC絡(luò)合法純化透明質(zhì)酸，通過測(cè)初始蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和剩余蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)去除率，如圖4所示.

圖4 常用方法蛋白質(zhì)去除率的比較Fig.4 Comparison of common methods for protein removal rate

從圖4可以看出：透明質(zhì)酸水提液直接使用酶解法其蛋白質(zhì)去除率可達(dá)88.1%，醇沉法蛋白質(zhì)去除率為60.7%，CPC絡(luò)合法蛋白質(zhì)去除率為62.6%.CPC絡(luò)合法并不比傳統(tǒng)酶解法、醇沉法對(duì)蛋白有更好的分離效果，這主要是不同蛋白的等電點(diǎn)不同，部分蛋白在水中帶負(fù)電與CPC絡(luò)合造成干擾.并且，生物組織所提取的透明質(zhì)酸往往是和蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，因此使用蛋白酶處理魚眼透明質(zhì)酸水提液能很好地分解透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)除蛋白的流程提供便利.綜上所述，在使用CPC法純化HA前應(yīng)盡量除去HA溶液中的蛋白，本實(shí)驗(yàn)最終確定的工藝流程先使用胰蛋白酶解法、Savage法、乙醇沉淀法和CPC法，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最終小于0.1%達(dá)到化妝品級(jí)別.

2.2.4 鹽離子濃度對(duì)HA和CPC絡(luò)合的影響

分別配置500 mL 0.1% HA的樣品液，加入一定量的NaCl使其鹽濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L，加入40 mL 1% CPC溶液，反應(yīng)60 min后取樣1 mL并離心，檢測(cè)上清液HA體積分?jǐn)?shù)，計(jì)算出HA回收率，如圖5所示.

圖5 NaCl濃度對(duì)HA、CPC絡(luò)合的影響Fig.5 Effects of NaCl concentration on percent recovery of HA

由圖5可知：透明質(zhì)酸在NaCl濃度為0 mol/L時(shí)幾乎不和CPC絡(luò)合，在0.1 mol/L至0.2 mol/L濃度下能和CPC較好的結(jié)合，HA回收率在95.2%左右，當(dāng)NaCl濃度逐漸增加，HA回收率明顯下降.因此，HA溶液應(yīng)添加適量NaCl，但其濃度應(yīng)控制在0.2 mol/L以內(nèi).

2.2.5 鹽離子濃度對(duì)HA-CPC絡(luò)合物解離的影響

實(shí)驗(yàn)室使用濃度為0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mol/L的NaCl溶液解離HA-CPC絡(luò)合物，解離液抽濾后醇沉，沉淀真空干燥.檢測(cè)樣品HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算HA回收率，如圖6所示.

圖6 NaCl濃度對(duì)HA、CPC絡(luò)合的影響Fig.6 Effects of NaCl concentration on percent recovery of HA purity

由圖6可以看出：過低濃度的NaCl溶液并不能很好地解離HA-CPC絡(luò)合物，當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí)，HA回收率達(dá)到91.3%并隨著NaCl濃度繼續(xù)增加保持穩(wěn)定.但是，終產(chǎn)品HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)了較為明顯的下降.根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，CPC能在低鹽的環(huán)境和許多酸性粘多糖(硫酸軟骨素、皮膚軟骨素和肝素等)形成絡(luò)合物，并在不同的高鹽濃度下分步解離.本實(shí)驗(yàn)中，金槍魚眼所提取的HA可能被所包含的硫酸軟骨素等雜多糖影響質(zhì)量分?jǐn)?shù).不同粘多糖的解離濃度是根據(jù)其電荷密度與酸根數(shù)量決定的(表1)，故高濃度的NaCl溶液會(huì)解離雜多糖與CPC形成的絡(luò)合物，進(jìn)而影響產(chǎn)品純度.因此，在解離HA-CPC絡(luò)合物時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制NaCl濃度，以達(dá)到不同粘多糖絡(luò)合物的解離條件，進(jìn)而能大大減少HA產(chǎn)品里面其他粘多糖的干擾，由圖6可得NaCl濃度為0.4 mol/L為最佳解離濃度.

表1 粘多糖的電荷密度和酸根值Table 1 Mucopolysaccharide charge density and acid radical

使用經(jīng)過優(yōu)化的CPC法工藝流程進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，CPC絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間為60 min，V(0.1% HA溶液)∶V(1% CPC溶液)=25∶2，絡(luò)合反應(yīng)NaCl濃度為0.2 mol/L，解離反應(yīng)NaCl濃度為0.4 mol/L時(shí)，能達(dá)到最好的分離效果，HA回收率91.3%，HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.1%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%.王婧茜[15]也做了CPC法純化透明質(zhì)酸的工藝優(yōu)化，主要包括反應(yīng)溫度、CPC使用量和初始溶液濃度等；而本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)CPC反應(yīng)時(shí)鹽離子的濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并以透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，最終結(jié)果也表明按照本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案所得的透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.1%，高于之前的研究(78.3%).

2.2.6 離子交換柱法純化透明質(zhì)酸

使用蒸餾水沖洗200 mL，后續(xù)再使用1.0 mol/mL NaCl溶液作為洗脫劑，沖洗400 mL，流速0.6 mL/min，每5 mL收集一管，采用上述硫酸咔唑法檢測(cè)HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)吸光度繪制洗脫曲線見圖7.

由圖7可知：當(dāng)洗脫液為蒸餾水時(shí)，即洗脫體積為0～200 mL時(shí)，沒有明顯的峰出現(xiàn)，HA沒有被洗脫下來.當(dāng)洗脫液為1.0 mol/mL NaCl時(shí)，即洗脫體積為330～400 mL時(shí)出現(xiàn)了明顯的狹窄的洗脫峰.此方法純化的透明質(zhì)酸回收率為74.3%，HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.2%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%.

2.3 IR分析

透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品和金槍魚眼提取純化透明質(zhì)酸紅外圖譜如圖8所示.

由圖8(a)可知：在3 417.8 cm-1處有強(qiáng)烈的—OH伸縮振動(dòng)的吸收峰，其峰寬而鈍，表明透明質(zhì)酸分子內(nèi)羥基是通過分子內(nèi)或者分子間氫鍵結(jié)合的.1 621.3 cm-1和1 411.6 cm-1為COO—的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1 148.3 cm-1和1 047.8 cm-1為多糖的特征吸收峰.與圖8(b)作比較，二者在特征區(qū)與指紋區(qū)主要吸收峰基本一致[16]，表明圖8(b)中檢測(cè)的樣品與Sigma所購?fù)该髻|(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，并且圖8(b)沒有蛋白和堿基的吸收峰，說明樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高.

圖8 透明質(zhì)酸紅外掃描圖譜Fig.8 Infrared absorption spectrum of hyaluronic acid

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定了一條廢棄金槍魚眼提取透明質(zhì)酸的工藝流程，通過酶解、醇沉和Savage等方法去除透明質(zhì)酸中的蛋白，CPC絡(luò)合法純化透明質(zhì)酸.本實(shí)驗(yàn)以透明質(zhì)酸回收率、HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，優(yōu)化CPC絡(luò)合法純化透明質(zhì)酸的條件.所得終產(chǎn)品HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.1%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，HA回收率為91.3%，所得的HA符合化妝品級(jí)別.通過離子交換法所得的HA樣品，HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.2%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，HA回收率74.3%.該方法雖然能夠進(jìn)一步提高HA品質(zhì)，但是會(huì)造成HA的損失，并且由于進(jìn)樣量、生產(chǎn)成本等因素的限制，更適合用于實(shí)驗(yàn)室純化研究.實(shí)驗(yàn)采用的工藝流程簡(jiǎn)單、有效，為金槍魚眼透明質(zhì)酸提取利用提供了應(yīng)用基礎(chǔ).實(shí)驗(yàn)中所得產(chǎn)品符合國家化妝品標(biāo)準(zhǔn)，但若要應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，需要進(jìn)一步提高透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù).HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.1%，所含雜質(zhì)可能為其他酸性粘多糖、中性粘多糖和無機(jī)鹽等，在之后的研究中，應(yīng)分析所提透明質(zhì)酸中的雜質(zhì)成分，根據(jù)不同雜質(zhì)對(duì)工藝流程進(jìn)行優(yōu)化.若所含雜質(zhì)為酸性粘多糖，則CPC法純化金槍魚眼透明質(zhì)酸的工藝條件可以進(jìn)一步優(yōu)化，以得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高的透明質(zhì)酸.本實(shí)驗(yàn)從金槍魚眼中提取透明質(zhì)酸得率為0.013%，雖然相較于雞冠、臍帶較低，但因我國金槍魚產(chǎn)業(yè)巨大，廢棄?mèng)~眼量多，故此工藝路線具有工業(yè)化潛力.

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