伍桃英

程云輝1

趙良忠2

歐陽(yáng)林3

許 宙1

(1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410076；2.邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；3.邵陽(yáng)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科，湖南 邵陽(yáng) 422000)

牛乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)以及多種維生素，是自然界賜予人類最理想的天然食品之一[1]。乳糖是乳類中特有的碳水化合物，牛乳中乳糖含量為4.6%～5.0%，占總糖量的99%以上[2]。正常生理?xiàng)l件下，乳糖經(jīng)小腸內(nèi)乳糖酶作用，水解為葡萄糖和半乳糖才能被人體吸收，但是當(dāng)人體內(nèi)乳糖酶缺乏或活力不夠時(shí)，攝入含乳糖的乳制品易發(fā)生乳糖吸收不良甚至乳糖不耐癥，這是制約乳及乳制品消費(fèi)的主要原因之一[3]。β-半乳糖苷酶能將牛乳中的乳糖水解成葡萄糖、半乳糖[4]。目前酶法水解乳糖制備低乳糖奶的方法有2種：① 采用低溫長(zhǎng)時(shí)水解法，即在線添加乳糖酶后，采用4～6 ℃水解12～20 h；② 采用高溫短時(shí)水解法，即采用中高溫酶，在30～40 ℃水解2～4 h。馬夫俠[5]、秦立虎[6]、常忠義[7]、王輝[8]等采用這2種方法對(duì)低乳糖奶的制備進(jìn)行了研究，但其乳糖水解率大多在60%～70%，只能一定程度上緩解乳糖不耐受癥狀。因此，采用β-半乳糖苷酶制備高水解率低乳糖奶，對(duì)滿足乳糖不耐癥患者的消費(fèi)需求及促進(jìn)中國(guó)乳品工業(yè)的發(fā)展仍具有十分重要的意義。本研究擬以乳糖水解率為考察指標(biāo)，利用游離的β-半乳糖苷酶對(duì)牛乳中的乳糖進(jìn)行水解，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，確定高水解率低乳糖奶水解的最佳工藝，并采用HPLC對(duì)低乳糖乳奶中的糖類進(jìn)行分析，以期為高水解率低乳糖奶工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：湖南亞華乳業(yè)有限公司；

Lactozyme：3 000 U/mL，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

Maxilact：3 000 U/mL，帝斯曼食品配料公司；

K3-T：5 000 U/g，山東天賜國(guó)際貿(mào)易有限公司；

Lactose F：300 U/g，日本天野酶制品株式會(huì)社；

葡萄糖試劑盒：上?？菩兰夹g(shù)研究所；

葡萄糖、半乳糖、乳糖：色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters600型，沃特世科技(上海)有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：SpectrumLab 22PC型，上海棱光技術(shù)有限公司；

臺(tái)式pH計(jì)：Delta320型，上海君達(dá)儀器儀表有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

可調(diào)式移液槍(20～200 μL)：Finnpipette型，熱電(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：CS202型，重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低乳糖奶的制備工藝

1.3.2 操作要點(diǎn)

(1) 配制復(fù)原乳：由于牛奶中乳糖含量為4.6%～5.0%，此次研究采用全脂奶粉按照1∶7 (g/mL)的復(fù)水比配制成復(fù)原乳，乳糖及其水解率的測(cè)定采用碘量法[9]，按式(1)計(jì)算乳糖水解率。

(1)

式中：

α——乳糖水解率，%；

c0——單質(zhì)碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V0——測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確移取的單質(zhì)碘的體積，mL；

cs——Na2S2O3溶液的濃度，mol/L；

V1、V2——酶解前、后牛奶濾液消耗Na2S2O3的體積，mL。

(2) 酶活測(cè)定：采用葡萄糖氧化酶試劑盒法[10]。

(3) 乳糖水解：復(fù)原乳經(jīng)95 ℃/15 s殺菌后冷卻到適宜溫度，以一定比例添加乳糖酶，于恒溫水浴振蕩器中水解一定時(shí)間。

1.3.3 HPLC法檢測(cè)牛奶中的糖類 采用高效液相色譜儀對(duì)牛奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖進(jìn)行定量檢測(cè)，樣品經(jīng)12 000 r/min離心后直接檢測(cè)，具體的HPLC條件[11]：

(1) 檢測(cè)葡萄糖、半乳糖的HPLC條件：Sugar-Pak I(6.5 mm×300 mm)色譜柱；流動(dòng)相：純水；檢測(cè)器靈敏度：4；柱溫：85 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

(2) 檢測(cè)乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件：Hpersil APS(4.6 mm×250 mm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈/水(75/25)；檢測(cè)器靈敏度：4；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖及低聚半乳糖分別按式(2)～(5)計(jì)算：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：

c1、c2、c3、c4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

c10、c20、c30、c40——標(biāo)樣中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

S1、S2、S3、S4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的峰面積，mV·min；

S10、S20、S30、S40——葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖標(biāo)樣的峰面積，mV·min。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備低乳糖奶的工藝研究

β-半乳糖苷酶的酶活采用葡萄糖氧化試劑盒測(cè)定，酶活見(jiàn)表1。

Lactase F乳糖酶為酸性乳糖酶，在中性的鮮乳或復(fù)原乳中酶活不高；Lactozyme、Maxilact、K3-T均為中性乳糖酶，其中Lactozyme、K3-T在40，45 ℃酶活較高且活性相當(dāng)，適用于牛乳中乳糖的分解，但K3-T較 Lactozyme價(jià)格高昂，因此，綜合選擇酶活較高、價(jià)格較低的Lactozyme乳糖酶作為制備低乳糖奶的游離酶種。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以[E]/[S]、水解溫度及時(shí)間為因素，以乳糖水解率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法[12-14](RSA)尋求酶解最優(yōu)工藝參數(shù)，RSA試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分別見(jiàn)表2、3。

表1 4種β-半乳糖苷酶的酶活Table 1 The enzyme activities and prices of three kinds of β-galactosidase

表2 RSA試驗(yàn)因素水平Table 2 Experimental factors and levels of RSA

表3 RSA試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of RSA

采用Design Expert 8.0.5B軟件對(duì)RSA試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到方程：

α=84.89+3.98A-0.80B+4.50C+0.12AB+1.95AC+0.82BC-2.78A2-11.79B2-1.08C2。

(6)

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用并確定最優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)Design-Expert繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行可視化分析，以水解率(α)作為響應(yīng)值，分別作水解溫度與水解時(shí)間、[E]/[S]與水解溫度、[E]/[S]與水解時(shí)間關(guān)系圖，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1反映了在[E]/[S]為1.25‰時(shí)，水解溫度與時(shí)間對(duì)乳糖水解率影響的響應(yīng)面曲線。由圖1可知，同一溫度下，乳糖水解率隨著水解時(shí)間的增加而增大；相同[E]/[S]與水解時(shí)間下，乳糖水解率與水解溫度呈拋物線變化。當(dāng)[E]/[S] 為1.25‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃、水解時(shí)間為3.0 h時(shí)，乳糖水解率最高可達(dá)90.65%。

圖2反映了在水解時(shí)間為2.5 h的條件下，[E]/[S]和水解溫度對(duì)乳糖水解率的影響。由圖2可知，隨著[E]/[S]的提高，乳糖水解率隨之增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與溫度呈拋物線變化趨勢(shì)。當(dāng)[E]/[S]為1.5‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃時(shí)，乳糖水解率可達(dá)89.13%。

表4 RSA 方差分析?Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

圖1 水解溫度與時(shí)間對(duì)乳糖水解率影響的響應(yīng)面與等高線圖([E]/[S]=1.25‰)
Figure 1 Response surface and contour plots surface of the effects of hydrolysis temperature and time on the hydrolysis rate of lactose

圖2 [E]/[S]與水解溫度對(duì)乳糖水解率影響的響應(yīng)面與等高線圖(水解時(shí)間2.5 h)Figure 2 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and Hydrolysis Temperature on the hydrolysis rate of lactose

圖3 [E]/[S]與水解時(shí)間對(duì)乳糖水解率影響的響應(yīng)面與等高線圖(水解溫度40 ℃)Figure 3 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and hydrolysis time on the hydrolysis rate of lactose

圖3反映了在水解溫度為40 ℃條件下，[E]/[S]與水解時(shí)間對(duì)乳糖水解率的影響。由圖3可知，同一溫度下，水解相同時(shí)間，乳糖水解率隨著[E]/[S]的增加而增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與水解時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)[E]/[S] 為1.5‰、水解時(shí)間為3.0 h時(shí)，乳糖水解率最高可達(dá)91.04%。

通過(guò)Design Expert軟件分析，得出水解牛乳中乳糖的最佳工藝條件為：[E]/[S]為1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時(shí)間3.0 h。在此條件下3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均得率為92.67%，與軟件估測(cè)值93.55%相近，說(shuō)明實(shí)際情況與優(yōu)化結(jié)果能良好吻合。

2.2 HPLC法分析乳中的糖類

低乳糖奶采用RSA得到的最佳工藝制備，復(fù)原乳與低乳糖奶樣品于95 ℃殺菌5 min，冷卻后12 000 r/min離心，用HPLC直接檢測(cè)。

2.2.1 樣品中乳糖、葡萄糖、半乳糖 在檢測(cè)葡萄糖、半乳糖的HPLC條件下，首先對(duì)乳糖(RT)、葡萄糖(PTT)、半乳糖(BRT)3個(gè)標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)，得到的色譜圖見(jiàn)圖4，各個(gè)標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間、峰面積與濃度數(shù)值見(jiàn)表5。復(fù)原乳與低乳糖奶中乳糖、葡萄糖、半乳糖的HPLC圖見(jiàn)圖5、6。

圖4 標(biāo)樣的色譜圖Figure 4 Chromatogram of standard samples

表5 標(biāo)樣的檢測(cè)結(jié)果Table 5 The test results of standard samples

圖5 復(fù)原乳中糖類的HPLC圖Figure 5 The HPLC diagrams of various sugars in milk

圖6 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 6 The HPLC diagrams of various sugars in low-lactose milk

由圖5、6可知，復(fù)原乳中的糖類主要是乳糖，含量為52.343 mg/mL，不含葡萄糖，半乳糖的含量極微，濃度為0.626 mg/mL；而低乳糖奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖的含量分別為6.086，9.964，26.101 mg/mL，說(shuō)明復(fù)原乳中近90%的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，生成了葡萄糖、半乳糖；但乳糖、葡萄糖、半乳糖的總和小于100%，說(shuō)明還有其他糖生成。

2.2.2 樣品中乳糖、低聚半乳糖 由于乳糖在水解過(guò)程中除生成葡萄糖、半乳糖之外，還生成了其他糖，在此對(duì)低聚半乳糖進(jìn)行研究。在檢測(cè)乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件下對(duì)低聚半乳糖對(duì)照品標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7和表6。

由圖8、9可知，復(fù)原乳中93.05%的糖是乳糖，通過(guò)HPLC還檢測(cè)出了另外3種糖，其含量合計(jì)為整個(gè)糖類的6.95%；而低乳糖奶中的乳糖、低聚半乳糖的含量分別為整個(gè)糖類的3.04%和14.02%，其余為單糖。說(shuō)明β-半乳糖苷酶有轉(zhuǎn)糖苷的作用，可生成功能性低聚糖。

圖7 低聚半乳糖對(duì)照品標(biāo)樣的色譜圖Figure 7 Chromatogram of galacto-oligosaccharide reference standard samples

表6 低聚半乳糖對(duì)照品標(biāo)樣的檢測(cè)結(jié)果?Table 6 Results of galacto-oligosaccharide reference standard samples

? 對(duì)照品中保留時(shí)間6.325 min的峰為乳糖，保留時(shí)間為5.948，6.737 min及以后出峰的為低聚半乳糖組分的峰。

圖8 復(fù)原乳中糖類的HPLC圖Figure 8 The HPLC diagrams of various sugars inreconstituted milk

圖9 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 9 The HPLC diagrams of various sugars in low lactose milk

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用Lactozyme制備高水解率低乳糖奶，通過(guò)響應(yīng)面確定最佳條件為：[E]/[S] 1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時(shí)間3.0 h，在此條件下制備的低乳糖奶的乳糖水解率高達(dá)92.67%，較前人[15]研究的乳糖水解率提高了20%～30%；通過(guò)HPLC分析，證明了復(fù)原乳中90%以上的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，同時(shí)在自制的低乳糖奶中有14.02%的低聚半乳糖生成，說(shuō)明了β-半乳糖苷酶既能水解乳糖，又有轉(zhuǎn)糖苷的作用。

本試驗(yàn)在乳糖水解中生成了大量的還原性單糖，其羰基與蛋白質(zhì)在滅菌過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致低乳糖奶產(chǎn)生非酶褐變，故需對(duì)低乳糖奶的褐變及其抑制進(jìn)行后續(xù)研究。

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