王杰斌

洪 霞1，2

錢瀅文1，2

柴宗龍1，2

周鑫魁1，2

張彥軍1，2

張亞鑫1，2

(1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州 730010)

乙烯利化學名2-氯乙基磷酸，是一種植物生長調節(jié)劑型農藥，在部分果蔬生產中使用普遍，被廣泛應用于農作物生長調節(jié)和水果蔬菜催熟，但使用不當，過量的乙烯利會造成果蔬中乙烯殘留，食用后可能產生危害，如加速衰老，腐蝕消化道，造成消化道潰瘍等[1]。近年來國外對果蔬中乙烯利殘留量都進行了嚴格限制，歐盟最新規(guī)定的果蔬中乙烯利最高限量為0.05 mg/kg[2]。

乙烯利是酸性較強的有機酸，在pH<3時穩(wěn)定存在, 在堿作用下降解、分解出乙烯，其不穩(wěn)定、揮發(fā)性低的特點決定了它不能直接用氣相色譜檢測[3]。目前報道的檢測方法有離子色譜法[4-6]、重氮甲烷衍生化-氣相色譜法[7-8]、頂空氣相色譜法[9-11]、LC/MS/MS法[12-14]、滴定法[15]等。離子色譜法使用不普遍且易存在其他離子干擾；重氮甲烷衍生反應迅速、高效、無副產物，但毒性大，不易貯存，制備過程中有爆炸的危險，且制備時間較長；頂空氣相色譜法操作簡單、穩(wěn)定、安全，但容易引入待測果蔬自身產生的乙烯，從而影響結果的準確性，且受頂空瓶體積大小和溫度變化的影響較大；LC/MS/MS法直接檢測能夠獲得較好的回收率和靈敏度，但是儀器昂貴，費用高，步驟多，耗時長，不利于普及和推廣。本試驗擬采用甲醇作為提取劑，通過液液萃取凈化后，研究最佳的硅烷化衍生條件，包括衍生試劑、衍生試劑和溶劑比例、衍生溫度、衍生時間等因素條件，用GC-FPD進行分析，建立一種前處理簡單、快速、安全，抗干擾能力強，靈敏度高，方法穩(wěn)定的果蔬中乙烯利殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

西紅柿、辣椒、橘子、香蕉、葡萄：實驗室送檢樣品。

甲醇、乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

鹽酸、吡啶、無水乙醚：分析純，西隴科學股份有限公司；

N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)：純度≥97%，北京百靈威科技有限公司；

N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)：純度≥98%，北京百靈威科技有限公司；

二硫赤蘚糖醇(DTE)：純度≥99.0%，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

乙烯利標準品[GBW(E)081909]：100 μg/mL，北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；

三甲基碘硅烷(TMIS)：純度≥98%(含穩(wěn)定劑銅)，北京百靈威科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜儀：Agilent7890B型，配火焰光度檢測器，安捷倫科技有限公司；

超聲波清洗機：SB-800DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9243BS-Ⅲ型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

氮吹儀：N-EVAP-24型，美國Organomation公司；

渦旋混勻器：Vortex 2型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準工作液的配制 準確吸取1 mL乙烯利標準物質(100 μg/mL)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的乙烯利標準儲備液，0～4 ℃冰箱中保存。根據(jù)檢測需要移取一定體積的標準儲備液用甲醇逐級稀釋成適當濃度的標準工作溶液，標準工作溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 衍生化試劑的配制 準確稱取0.01 g二硫赤蘚糖醇，分別溶解于5 mLN-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)或N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)中，在液面下加入10 μL三甲基碘硅烷，混勻，配制成MSTFA衍生化試劑和BSTFA衍生化試劑，0～4 ℃冰箱中放置過夜后使用，避光防潮密封保存。

1.2.3 儀器條件 色譜柱：DB-17石英毛細管柱[30 m×0.53 mm(內徑)×0.50 μm]；進樣口溫度：220 ℃；升溫程序：120 ℃(2 min)→10 ℃/min→220 ℃(1 min)；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；檢測器溫度：240 ℃；載氣：高純氮氣(99.999%以上)；流速：5 mL/min；空氣：100 mL/min；氫氣：75 mL/min；尾吹氣：60 mL/min。

1.2.4 樣品前處理

(1) 樣品制備：西紅柿、辣椒、葡萄去柄，橘子、香蕉去皮后直接放入勻漿機勻漿，放入聚乙烯瓶中在-20～-16 ℃保存。

(2) 提取：稱取樣品10.00 g于聚乙烯燒杯中，加入0.5 mL 甲醇鹽酸溶液和25 mL甲醇，超聲震蕩5 min，過濾于50 mL的聚乙烯容量瓶中，殘渣再用15 mL甲醇提取一次，合并提取液于50 mL聚乙烯容量瓶中并定容至刻度。準確吸取10 mL上述定容溶液放入15 mL離心管中，在干燥氮氣流下于30～35 ℃水浴上濃縮至1.5 mL，加入0.5 mL甲醇鹽酸溶液和8 mL無水乙醚，充分混合，放置10 min，將上清液移入另一聚乙烯離心管中，殘留液用1 mL無水乙醚萃取2次，萃取液并入上述清液中，于30～35 ℃水浴上濃縮至約0.5 mL[16]。用移液槍轉移至樣品反應瓶中，用0.5 mL的乙醚清洗離心管，合并至同一樣品反應瓶中，氮氣吹干，待衍生。

1.2.5 衍生條件的優(yōu)化

(1) 衍生試劑的選擇：

① 吸取15.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入100 μL MSTFA和50 μL乙腈，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min[17]；

② 吸取15.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入100 μL BSTFA和50 μL乙腈，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min；

③ 吸取15.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入100 μL MSTFA和50 μL吡啶，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min；

④ 吸取15.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入100 μL MSTFA和50 μL吡啶，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min；

⑤ 吸取10.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入1.2.2中事先配好的MSTFA衍生化試劑，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min；

⑥ 吸取10.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后加入1.2.2中事先配好的BSTFA衍生化試劑，衍生化小瓶加蓋后放入烘箱在65 ℃衍生40 min；

衍生結束后，將衍生產物轉移至250 μL襯管，再放入樣品瓶中進樣測定，同時做空白試驗。

(2) 衍生試劑與溶劑比例的選擇優(yōu)化：分別吸取10.0，12.5，15.0，17.5，20.0，22.5，25.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，在氮氣吹干后加入100 μL BSTFA或MSTFA溶液，再依次加入0，25，50，75，100，125，150 μL 的乙腈(待衍生液中乙烯利濃度均為1 μg/mL)，進樣瓶加蓋后放入烘箱60 ℃衍生40 min，冷卻至室溫，將衍生產物轉移至250 μL襯管，再放入樣品瓶中進樣測定。

(3) 衍生溫度的選擇：吸取9組15.0 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后，加入100 μL BSTFA和50 μL乙腈。進樣小瓶加蓋后放入烘箱，分別在40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃下衍生40 min。冷卻至室溫，將衍生產物轉移至250 μL襯管，再放入樣品瓶中進樣測定。

(4) 衍生時間的選擇：吸取10組15 μL乙烯利標準物質(10 μg/mL)至2 mL進樣小瓶，氮氣吹干后，加入100 μL BSTFA和50 μL乙腈。衍生化小瓶加蓋后放入烘箱65 ℃進行衍生反應，控制衍生反應時間依次為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 min。冷卻至室溫，將衍生產物轉移至250 μL 襯管，再放入樣品瓶中進樣測定。

2 結果與討論

2.1 衍生試劑的選擇

乙烯利分子上的羥基容易與硅烷化試劑發(fā)生反應生成硅脂；本試驗比較了N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)和N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)與乙烯利在不同的衍生條件下發(fā)生硅烷化反應的可行性。濃度為1 μg/mL的乙烯利標準溶液在各衍生條件下得到的衍生物——雙(三甲基硅烷基)乙烯利在FPD檢測器上的峰高與出峰情況見圖1～6。

由圖1～6可知，衍生得到的雙(三甲基硅烷基)乙烯利在4.6 min左右出峰，衍生方法⑤、⑥得到的衍生產物在氣相上有較好的響應值，但因加入催化劑和保護劑出現(xiàn)極大的雜峰，且會造成色譜柱的流失和檢測器靈敏度的下降。衍生方法①～④得到的衍生產物都具有良好的響應值，且雜峰較少；但以吡啶作為溶劑時會出現(xiàn)明顯的峰拖尾，且吡啶毒性大，故最終選擇衍生方法為①、②。

2.2 衍生試劑和溶劑比例的選擇

由圖7可知，以MSTFA作為硅烷化試劑時，加入100 μL 乙腈進行衍生化反應得到的產物峰面積最大；以BSTFA作為硅烷化試劑時，加入50 μL乙腈進行衍生化反應得到的產物峰面積最大，且峰面積比前者要大；因此本試驗采用在吹干的提取物殘渣中加入100 μL BSTFA、50 μL乙腈對樣品進行分析。

2.3 衍生溫度的選擇

由圖8可知，硅烷化反應于45 ℃左右開始發(fā)生，到65 ℃ 時趨于穩(wěn)定，之后再提高溫度，峰面積沒有明顯的變化。由于溫度太高會導致溶劑的揮發(fā)及其他副反應的發(fā)生，故采用65 ℃作為最佳反應溫度。

圖1 衍生條件①得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 1 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ①

圖2 衍生條件②得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 2 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ②

圖3 衍生條件③得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 3 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ③

圖4 衍生條件④得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 4 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ④

圖5 衍生條件⑤得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 5 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ⑤

圖6 衍生條件⑥得到的乙烯利衍生物和空白對照的色譜圖Figure 6 Chromatograms of ethephon derivatives and blank control obtained from derived conditions ⑥

2.4 衍生時間的選擇

由圖9可知，在30 min左右時反應產物的峰面積趨于穩(wěn)定，說明此時衍生化反應結束。為保證反應完全，以35 min 作為最佳反應時間。

2.5 方法的標準曲線，線性范圍，相關系數(shù)，檢出限

根據(jù)建立的試驗方法，選取空白樣品基質配制10，20， 50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 μg/L標準溶液，以峰面積對乙烯利的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。不同基質配制的乙烯利線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限見表1。

圖 7 2種衍生試劑與不同體積乙腈混合的衍生效果比較圖Figure 7 Comparison diagram of the derivatization effects of two kinds of derivatization reagents mixed with different volumes of acetonitrile

圖8 不同反應溫度下的衍生效果圖Figure 8 Derivative effect diagram at different reaction temperatures

圖9 不同反應時間下的衍生效果圖Figure 9 Derivative effect diagram at different reaction times

由表1可知：乙烯利濃度為10～5 000 μg/L時線性關系良好，相關系數(shù)R2均在0.999以上；方法的最低檢出限(S/N≥3)為1 μg/kg，定量限(S/N≥10)為3 μg/kg，符合分析方法的要求。

2.6 回收率和精密度

用陰性果蔬樣品基質中進行乙烯利標準溶液的加標回收試驗，在5，20，100 μg/kg 3個加標水平下，按本試驗方法進行前處理，每個濃度水平重復測定6次。乙烯利在5種果蔬中的加標回收率見表2，相對標準偏差見表3。

表1 不同基質中乙烯利的線性方程、相關系數(shù)Table 1 Linear equation, correlation coefficient of ethephon in different substrates

表2 不同樣品基質中乙烯利的加標回收率Table 2 The recovery rate of ethephon in different sample substrates

表3 不同樣品基質中乙烯利的相對標準偏差Table 3 The relative standard deviation of ethephon in different sample substrates

由表2、3可知：3種添加水平下不同基質中乙烯利的回收率為84.3%～95.1%，相對標準偏差為1.31%～3.92%，滿足痕量分析的要求。

2.7 方法的應用

分別采用GB 23200.16—2016《食品國家安全標準 水果及蔬菜中乙烯利殘留量的測定 氣相色譜法》、頂空氣相色譜法[18]和本試驗的方法對送檢的40份果蔬樣品進行檢測,結果見表4。

表4 不同檢測方法下乙烯利的測試結果Table 4 Test results of ethephon under different detection methods

由表4可知，頂空氣相色譜法利用乙烯利在堿性環(huán)境中受熱快速分解為乙烯這一特性來檢測，但乙烯在GC-FID上的響應值一般，故當樣品中乙烯利殘留量較低時可能會有假陰性的現(xiàn)象，且容易受到果蔬自身產生的乙烯干擾，出現(xiàn)假陽性。比較GB 23200.16—2016方法利用重氮甲烷衍生得到的二甲基乙烯利和本研究方法得到的雙(三甲基硅烷基)乙烯利，發(fā)現(xiàn)后者在GC-FPD上的響應值要高于前者，且GB 23200.16—2016方法衍生所用重氮甲烷制備過程有發(fā)生爆炸的危險，且不易貯存。本研究方法定性準確，靈敏度高，無制備重氮甲烷的危險，具有明顯的檢測優(yōu)勢。

3 結論

本試驗在單因素試驗分析的基礎上，通過對衍生試劑、衍生試劑和溶劑比例、衍生溫度、衍生時間等因素條件的優(yōu)化，得到最佳衍生條件(在吹干的提取物中加入100 μL BSTFA和50 μL乙腈，于烘箱中65 ℃衍生35 min)；建立了三甲基硅烷化衍生氣相色譜法測定蔬菜、水果中乙烯利殘留量的快速檢測分析方法。結果表明：該方法前處理簡單，所使用的硅烷化試劑可直接購買，有效地解決了重氮甲烷衍生氣相色譜法中制備重氮甲烷繁瑣危險的問題，衍生物雙(三甲基硅烷基)乙烯利抗干擾能力強，能較好地避免假陽性現(xiàn)象；且試驗獲得了良好的回收率和精密度，適合蔬菜、水果中乙烯利殘留量的日常檢測，可為乙烯利及類似結構物質含量檢測提供參考。

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