趙 犇

王 武1

李昌靈2

楊海麟1

(1.江南大學生物工程學院教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.懷化學院生物與食品工程學院，湖南 懷化 418000)

隨著世界范圍內(nèi)能源和資源的日益緊張，可再生能源與資源的研究與開發(fā)已成為關(guān)注熱點。近幾年，各國紛紛開始在微藻生物燃料和營養(yǎng)化學品領域謀求突破與發(fā)展：美國能源部宣布將投資1 800萬美元用于藻類生物燃料與生物基產(chǎn)品研究；歐盟也積極投資藻類研究，旨在示范從藻種選育、培養(yǎng)條件優(yōu)化、油脂提取、生物燃料生產(chǎn)等過程[1]。微藻在食品資源方面的利用涉及到裂殖壺菌，又稱裂壺藻，是屬于破囊壺菌科的單細胞海洋微藻，在一定的培養(yǎng)條件下，裂殖壺菌胞內(nèi)油脂中二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)含量較高，是值得研究和深度開發(fā)的生物合成DHA的優(yōu)質(zhì)種源[2]。

DHA為ω-3多不飽和脂肪酸，是一種重要的食品添加劑。它是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分，還具有抗癌、消炎、預防心血管疾病等諸多功能[3-4]，其保健和醫(yī)療功效越來越受到重視。與傳統(tǒng)的深海魚油生產(chǎn)DHA的方式相比，裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA具有培養(yǎng)簡單、無季節(jié)波動、目的產(chǎn)物含量比高、無污染、無魚腥味、成本低、不影響海洋生態(tài)等優(yōu)點[5]，裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA開始進入了工業(yè)化階段[6]。

近些年，不斷見到優(yōu)化裂殖壺菌發(fā)酵，提高DHA產(chǎn)量的研究報道，如發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[7-9]、pH調(diào)控[10-11]、溶氧調(diào)控[12-14]、補料策略優(yōu)化[15]等，靠傳統(tǒng)發(fā)酵策略提高DHA的發(fā)酵生產(chǎn)強度的余地越來越小。而借助遺傳育種手段，培育高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌變異株仍有一定的發(fā)展空間，這也是發(fā)酵法提高DHA生產(chǎn)強度的上游基礎。

裂殖壺菌基因組約39 Mb[16]，且裂殖壺菌代謝體系中脂肪酸合成途徑復雜，既存在短鏈飽和脂肪酸的脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)合成途徑，又存在長鏈不飽和脂肪酸的聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的合成通路[17]。盡管基因工程已普遍應用于微生物育種，并且在裂殖壺菌上也有所研究[18-19]，但考慮到裂殖壺菌復雜的遺傳背景和尚不十分明晰的DHA合成途徑，物理和化學誘變?nèi)耘f是可以考慮的選擇。

甲基磺酸乙酯(EMS)誘變?yōu)榛瘜W誘變，其作用機制是對DNA上高密度的堿基進行烷化作用，形成轉(zhuǎn)換型或置換型突變[20]。目前EMS誘變在微生物育種以及農(nóng)作物的優(yōu)良品種選育上廣泛應用，并獲得了不錯的效果[21-22]。常壓室溫等離子體(ARTP)是一種新型的誘變技術(shù)，它利用大氣壓輝光放電，產(chǎn)生多種活性粒子，作用于DNA上，引發(fā)基因突變[23]，它具有操作簡單、可控性強、誘變效果好的特點，已逐步開始在科研與工業(yè)領域發(fā)揮重要作用[24]。由于單種誘變方法往往會使菌種產(chǎn)生抗性，或得到的誘變菌株性能不夠穩(wěn)定，在實際應用中往往采用2種或多種誘變方式相結(jié)合的方法進行誘變，即復合誘變[25]。

裂殖壺菌具有多層的細胞壁結(jié)構(gòu)保護著胞內(nèi)物質(zhì)[26]，DHA的合成途徑與代謝機制又十分復雜。以往針對裂殖壺菌的育種手段往往采用單一的誘變方法，這會產(chǎn)生誘變效果差、誘變效率低或誘變株性能不穩(wěn)定、易退化等問題，如呂曉義等[27]僅僅利用60Co-γ射線輻照誘變裂殖壺菌，獲得的誘變菌產(chǎn)量只有5.65 g/L；梁園梅等[28]采用單一UV誘變育種，獲得的誘變株性能也沒有突出的提升。欲獲得性狀良好、遺傳穩(wěn)定的裂殖壺菌高產(chǎn)DHA變異株，本研究將EMS-ARTP復合誘變方法應用于裂殖壺菌誘變育種，以期獲得裂殖壺菌高產(chǎn)DHA誘變菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌株：裂殖壺菌(Schizochytriumsp.S31，ATCC 20888)，美國菌種保藏中心；

脂肪酸：標準品，美國Sigma公司；

正己烷：HPLC級，美國Fisher公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

離心機：3K15型，德國Sigma公司；

分光光度計：T6新世紀型，北京普禧通用儀器有限公司；

ARTP誘變儀：ARTP-III型，北京思清源生物科技有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，日本島津公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

790 By+固體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨1 g/L、酵母粉1 g/L、瓊脂20 g/L、海水晶17.5 g/L，121 ℃ 滅菌20 min；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、海水晶15 g/L、VB10.05 g/L、VB60.05 g/L、VB120.000 5 g/L，115 ℃滅菌20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨5.6 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、磷酸二氫鉀2.5 g/L、硫酸鎂7.2 g/L、硫酸鈉 12.8g/L、氯化鈣 0.4 g/L、海水晶17.5 g/L、VB10.1 g/L、VB60.1 g/L、VB120.001 g/L，115 ℃滅菌20 min；

0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)：用雙蒸水分別溶解24.00 g 磷酸二氫鈉和28.39 g磷酸氫二鈉至1 000 mL，然后混合280 mL磷酸二氫鈉溶液和720 mL磷酸氫二鈉溶液，121 ℃滅菌20 min，備用；

EMS溶液：取5 mL EMS原液，加入到15 mL預冷的乙醇溶液中，加蓋并輕輕轉(zhuǎn)動試管混合均勻。

1.2 方法

1.2.1 裂殖壺菌誘變菌株制備

(1) 菌懸液制備：將裂殖壺菌接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。取1 mL培養(yǎng)液3 000 r/min離心5 min收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2次后稀釋至OD540為0.6～0.7(以PBS緩沖液為參比管)。

(2) EMS誘變株制備：在10 mL菌懸液中加入400 μL EMS溶液，輕輕搖勻后置于搖床，28 ℃、200 r/min條件下分別處理0，10，20，30，40，50，60 min(0 min為對照組)，取出后用5%硫代硫酸鈉溶液洗滌2～3次終止反應，細胞用PBS緩沖液懸浮后吸取100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基平皿上，置于30 ℃避光培養(yǎng)4 d。

(3) ARTP誘變株制備：吸取20 μL菌懸液，均勻涂抹在滅過菌的載物鐵片上，將鐵片置于ARTP誘變儀載物臺上，用高純氦氣等離子體誘變分別處理0(對照組)，5，10，15，20，25 s，誘變參數(shù)為：電源功率100 W，氦氣流量10 L/min，照射距離2 mm。ARTP誘變處理后，將鐵片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL PBS緩沖液的EP管中，震蕩洗脫菌體。吸取100 μL菌體懸浮液均勻涂布于固體培養(yǎng)基平皿上，置于30 ℃避光培養(yǎng)4 d。

(4) EMS-ARTP復合誘變菌制備：將EMS誘變處理40 min 后制備的誘變菌懸液吸取100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基平皿上，置于30 ℃避光培養(yǎng)4 d。混合平皿上長出的單菌落，并挑取一環(huán)，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，按1.2.1(1)制備菌懸液，然后按1.2.1(3)經(jīng)ARTP照射誘變15 s，獲得EMS-ARTP復合誘變菌。其中對照組EMS處理時間0 min，ARTP照射時間0 s。

1.2.2 致死率、突變率計算

(1) 致死率計算：各誘變試驗中，對對照組和誘變組固體培養(yǎng)基平皿上長出的菌落進行計數(shù)。按式(1)計算致死率。

(1)

式中：

rL——致死率，%；

N0——對照組菌落數(shù)；

Nm——誘變組菌落數(shù)。

(2) 突變率計算：各誘變試驗中，選取致死率為80%～90%的處理時間作為最終誘變時間。在該誘變時間下對裂殖壺菌進行誘變處理，平板培養(yǎng)4 d后各組隨機挑選50株菌，搖瓶培養(yǎng)120 h后測DHA產(chǎn)量，記產(chǎn)量高于原始菌株10%的誘變株為正突變株，產(chǎn)量低于原始菌株10%的誘變株為負突變株，并按式(2)計算突變率。

(2)

式中：

rm——突變率，%；

rP——正突變率，%；

rN——負突變率，%；

NP——正突變株菌株數(shù)；

NN——負突變株菌株數(shù)。

1.2.3 分析方法

(1) 生物量測定：各誘變株搖瓶培養(yǎng)120 h后，取5 mL發(fā)酵液于離心管中，8 000 r/min離心15 min，用雙蒸水洗滌離心2次，冷凍干燥后稱重計算生物量。

(2) 含油量測定：采用磷酸香草醛法[29]。

(3) 脂肪酸含量測定：采用氣相色譜法[11]。

各誘變組選取5株DHA產(chǎn)量最高的菌株，其發(fā)酵平均水平作為該誘變方法下得到的高產(chǎn)菌的發(fā)酵水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變劑量的確定

2種誘變方法對裂殖壺菌的致死效應見圖1。裂殖壺菌菌體的致死率與EMS處理時間存在明顯的正相關(guān)效應，當EMS處理時間為40 min時，致死率達到87%。因此，選取40 min作為EMS處理的誘變劑量。

裂殖壺菌菌體的致死率隨著ARTP照射時間的延長而顯著增加。當照射時間在15 s以上時，致死率曲線趨于平緩，可能是細胞SOS修復機制的激活，突變率開始增加[30]。此時，裂殖壺菌的致死率達到80%以上。因此，選取15 s作為ARTP照射的誘變劑量。

從圖1可以看出，對裂殖壺菌誘變的化學處理中，致死率對應于處理時間，形成較為平緩的上升曲線，而物理誘變中，致死率對應于照射時間則顯得陡峭，說明準確掌控照射時間點非常重要。

圖1 2種誘變方法對裂殖壺菌的致死效應Figure 1 Lethal effects of 2 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.2 EMS、ARTP和EMS-ARTP處理突變率的對比

分別使用EMS、ARTP和EMS-ARTP復合誘變3種誘變方法對裂殖壺菌進行誘變處理，并對誘變株進行搖瓶培養(yǎng)后測DHA產(chǎn)量，統(tǒng)計正、負突變率，結(jié)果見圖2。3種誘變方法對裂殖壺菌的誘變效果呈現(xiàn)出一定的差異性。比較2種單因子誘變方法，裂殖壺菌突變率相差不大，介于40%與45%之間，但是在ARTP突變株中，正突變株的數(shù)量占到約60%，遠高于負突變株；而在EMS突變株中，正、負突變株數(shù)量相當。EMS-ARTP復合誘變后，突變率達到55.7%，明顯高于2種單因子誘變。其中正突變率達到32.2%，遠遠高于負突變率。

對裂殖壺菌而言，3種突變方法形成的突變率截然不同。表觀上分析，推測EMS-ARTP復合誘變造成了更豐富的突變位點，因此回復突變的頻率遠遠低于單因子誘變。

圖2 3種誘變方法對裂殖壺菌誘變處理的突變率Figure 2 Mutation rate of 3 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.3 高產(chǎn)誘變株的關(guān)鍵發(fā)酵指標類比

從3種誘變方法獲得的誘變株當中各挑選5株DHA產(chǎn)量最高的菌株，其發(fā)酵平均水平作為該誘變方法下得到的DHA高產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平，結(jié)果見表1、2。從表1可知，與出發(fā)菌株相比，3種DHA高產(chǎn)菌株的生物量無明顯的變化，而在含油量上，均有不同程度的提高，其中EMS誘變高產(chǎn)株含油量提升略高于ARTP誘變的，而復合誘變高產(chǎn)株含油量最高，達到51%。如表2所示，EMS誘變高產(chǎn)株的DHA較出發(fā)菌株無明顯變化，而ARTP誘變高產(chǎn)株和復合誘變高產(chǎn)株DHA含量均得到了提升，分別約為40%和43%?；谏鲜鲎兓罱K3種誘變菌的DHA產(chǎn)量均得到了一定程度的提升，其中EMS-ARTP復合誘變高產(chǎn)株的產(chǎn)量達到了7.2 g/L，提升了近36%，效果最明顯。

3種DHA高產(chǎn)菌株的脂肪酸組成與出發(fā)菌株具有明顯的差異，見表2。EMS誘變高產(chǎn)株的主要FAS產(chǎn)物，如C14∶0和C16∶0略有增加，主要PKS產(chǎn)物二十二碳五烯酸(DPA)出現(xiàn)下降現(xiàn)象；而ARTP和復合誘變高產(chǎn)株的FAS產(chǎn)物和PKS產(chǎn)物變化與EMS誘變高產(chǎn)株正好相反，如復合誘變高產(chǎn)株的FAS產(chǎn)物由原始菌株的42.3%下降到38.6%，而PKS產(chǎn)物由原始菌株的44.9%上升到55.2%。

表1不同高產(chǎn)DHA裂殖壺菌誘變株發(fā)酵性能分析?
Table 1 Analysis of fermentation performances on different high DHA yieldSchizochytriummutants (n=3)

菌株生物量/(g·L-1)含油量/%DHA產(chǎn)量/(g·L-1)w36．41±1．3645．51±2．085．28±0．35mEMS37．01±1．2848．45±2．585．74±0．33mARTP36．82±1．5547．94±2．676．28±0．28mEA36．88±1．2751．15±2．077．16±0．30

? w：原始菌株；mEMS：EMS誘變菌株；mARTP：ARTP誘變菌株；mEA：EMS-ARTP復合誘變菌株。

表2 不同高產(chǎn)DHA裂殖壺菌誘變株脂肪酸組成?Table 2 Fatty acids composition of different high DHA yield Schizochytrium mutants (n=3) %

? w：原始菌株；mEMS：EMS誘變菌株；mARTP：ARTP誘變菌株；mEA：EMS-ARTP復合誘變菌株。

2.4 高產(chǎn)誘變株遺傳穩(wěn)定性

將3種誘變方法獲得的高產(chǎn)DHA誘變株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察其遺傳的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。經(jīng)過5代的傳代培養(yǎng)，EMS誘變高產(chǎn)株和ARTP誘變高產(chǎn)株的發(fā)酵指標都出現(xiàn)了一定程度的退化，而復合誘變高產(chǎn)株的發(fā)酵指標保持相對穩(wěn)定，其DHA含量為42.2%～43.3%，DHA產(chǎn)量為7.0～7.2 g/L，與一代菌無明顯差異，遺傳穩(wěn)定性良好。

2.5 誘變方法對裂殖壺菌誘變機理

由3種誘變方法對裂殖壺菌的誘變結(jié)果分析可知，EMS產(chǎn)生的誘變效果弱于ARTP，而復合誘變的效果最好。EMS具有烷化DNA堿基的機理，可引發(fā)嘌呤和嘧啶轉(zhuǎn)換[22]。在本試驗中，EMS誘變高產(chǎn)株的含油量高于出發(fā)菌株，但DHA占總脂肪酸的相對含量與出發(fā)菌相比相差不大，說明其脂肪酸合成能力得到了提升，但DHA合成的特定代謝途徑并未增強。

ARTP誘變?yōu)樾滦偷恼T變育種方法，它集合了質(zhì)量、能量和電荷等損傷因素，產(chǎn)生不同的DNA損傷機制，遺傳多樣性更豐富[31]。Umu-test顯示ARTP對基因的損傷能力遠高于UV和常規(guī)化學誘變方法[32]。ARTP輻射的高活性粒子溫度接近室溫，不會對菌體產(chǎn)生熱致死效應。在本試驗中，將ARTP誘變技術(shù)應用于裂殖壺菌選育高產(chǎn)DHA菌株，取得了良好的效果，正突變率遠遠高于負突變率。通過發(fā)酵數(shù)據(jù)和脂肪酸組成的分析可以發(fā)現(xiàn)，ARTP高產(chǎn)株的含油量和DHA產(chǎn)量明顯提升，而且脂肪酸組成中PKS產(chǎn)物也有了相應的提升，說明誘變株在合成脂肪酸前體物質(zhì)的相關(guān)合成基因和PKS途徑的特定基因都有可能發(fā)生了變異。

考慮到裂殖壺菌復雜的脂肪酸合成途徑，單點或少數(shù)幾個點的誘變往往不能對DHA的產(chǎn)量產(chǎn)生顯著、穩(wěn)定的改變。將化學誘變和物理誘變相結(jié)合，對裂殖壺菌進行EMS-ARTP復合誘變，誘變機制更多樣，突變位點更豐富，獲得DHA高產(chǎn)菌的概率也更大。通過EMS-ARTP復合誘變得到的高產(chǎn)菌株，DHA產(chǎn)量達到7.2 g/L。李慧玲等[33]采用DES-UV復合誘變結(jié)合丙二酸、碘乙酸聯(lián)合篩選，得到誘變菌株XN001，其DHA產(chǎn)量為5.5 g/L；許永等[34]采用紫外誘變和喹禾靈篩選的方法，篩得的菌株OUC007，其DHA產(chǎn)量為1.2 g/L；袁軍等[35]通過ARTP誘變與強氧化劑施壓篩選得到的菌種D32，其DHA產(chǎn)量達到7.3 g/L。通過本試驗的誘變方法篩選得到的高產(chǎn)誘變菌株，在未使用任何篩選試劑的情況下，已獲得較高DHA產(chǎn)量。該產(chǎn)量與近期報道的相同菌種、相同發(fā)酵規(guī)模的數(shù)據(jù)相比，已十分具有競爭力(表3)。后期經(jīng)過合適的篩選方法和發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化后，有望進一步提高DHA生產(chǎn)能力。

表3 不同破囊壺菌DHA產(chǎn)量和DHA含量比較Table 3 Comparative results of DHA production and percentage among different studies by thraustochytrids

圖3 高產(chǎn)誘變株傳代次數(shù)對發(fā)酵指標的影響Figure 3 Effects ofculture passages on fermentation performance of high DHA yield Schizochytrium mutants

3 結(jié)論

將EMS-ARTP復合誘變的方法應用于裂殖壺菌誘變選育高產(chǎn)DHA菌株，并對復合誘變獲得的DHA高產(chǎn)菌株與單因子誘變高產(chǎn)菌株進行比較分析得出，EMS-ARTP復合誘變高產(chǎn)菌株無論在DHA產(chǎn)量還是在遺傳穩(wěn)定性上，都優(yōu)于單因子誘變。再加上后期的理性篩選技術(shù)及定向施壓培養(yǎng)的應用，有望進一步提高裂殖壺菌合成DHA的產(chǎn)率，繼而提高工業(yè)化生產(chǎn)DHA的效能。

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