齊 亮

趙茂程1,3

趙 婕1,4

唐于維一1

(1.南京林業(yè)大學(xué)機(jī)械電子工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京師范大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210046；3.泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300；4.南京工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院航空工程學(xué)院，江蘇 南京 210023)

豬肉是中國(guó)主要的肉類消費(fèi)品種。隨著生活水平提高與科技進(jìn)步，人們對(duì)豬肉品質(zhì)的要求更加全面與精細(xì)。豬肉的品質(zhì)包括營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味、嫩度、保水性和新鮮度等要素[1]71，不僅可以用有損檢測(cè)方法細(xì)致精確地獲得這些指標(biāo)，還可以通過無(wú)損檢測(cè)方法快速在線獲取，其中光譜分析技術(shù)是一種重要的無(wú)損檢測(cè)手段。目前，紅外光譜分析技術(shù)比較成熟[2-3]，而太赫茲(Terahertz，THz)光譜分析技術(shù)才剛剛起步[4]。

豬肉的各類組織——肌肉、脂肪、皮膚都能體現(xiàn)豬肉的品質(zhì)。為了探索THz無(wú)損檢測(cè)豬肉品質(zhì)的可行性，需要首先觀察不同組織在THz波段是否有顯著區(qū)分，再進(jìn)一步研究各組織的品質(zhì)在THz波段的表達(dá)。

一般通過反射模式或透射模式測(cè)量肉組織的THz光學(xué)特性。但是水能強(qiáng)烈吸收THz波，使得含水豐富的鮮肉組織透射信號(hào)的信噪比低，影響THz光學(xué)參數(shù)的測(cè)量精確性。對(duì)于稍厚的組織樣品，幾乎無(wú)法探測(cè)到透射信號(hào)[5]。一般采用脫水[6]、冷凍切片[7]等方法，避免水對(duì)THz波的強(qiáng)烈吸收，但是這些預(yù)處理會(huì)影響新鮮組織的水合狀態(tài)及組織結(jié)構(gòu)，難以實(shí)現(xiàn)新鮮組織的快速無(wú)損檢測(cè)。反射式雖然不需要復(fù)雜的預(yù)處理，對(duì)樣品厚度沒有要求，但是反射波的能量損失較多、信噪比低，需要通過試驗(yàn)嘗試選擇適合樣本的特定反射角度，以獲得最大的信噪比[8-9]。此方法的調(diào)試時(shí)間長(zhǎng)，缺乏通用性。本研究擬引入衰減全反射 (attenuated total reflectance，ATR)檢測(cè)模式，克服豬肉樣本中水分的干擾，獲取并分析豬肉的肌肉、脂肪和皮膚組織在ATR模式下的THz光譜，研究THz-ATR技術(shù)應(yīng)用到組織類型鑒別的可行性以及在豬肉品質(zhì)無(wú)損檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬肉：宰后排酸12 h的豬通脊肉，南京市學(xué)衡路蘇果超市；

純水：用Milli-Q Academic超純水儀制備。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超純水儀：Milli-Q Academic型，美國(guó)Millipore公司；

THz光譜分析儀：TAS7500SP型，使用鈦寶石泵浦激光器，激光輸出功率為20 mW，中心波長(zhǎng)1 550 nm，脈沖寬度約50 fs，重復(fù)頻率50 MHz，日本Advantest公司。

1.2 試驗(yàn)原理

1.2.1 THz光譜分析儀工作原理 THz光譜分析儀采用電控光學(xué)取樣法(electronically controlled optical sampling，ECOPS)產(chǎn)生和探測(cè)THz脈沖信號(hào)[10-11]。如圖1所示，它使用2個(gè)激勵(lì)頻率稍有差異的飛秒激光器同時(shí)泵浦光電導(dǎo)天線，其中激光器1通過光纖將飛秒激光脈沖入射到THz發(fā)生器，在偏置電場(chǎng)作用下利用光電導(dǎo)天線產(chǎn)生THz脈沖，經(jīng)拋物面鏡反射進(jìn)入由硅晶體制成的ATR棱鏡并產(chǎn)生全反射。載有樣品信息的全反射波從棱鏡射入探測(cè)端的光電導(dǎo)天線，與激光器2泵浦的飛秒激光脈沖相調(diào)制，產(chǎn)生激發(fā)電流，通過探測(cè)電流可以獲得樣品的THz-ATR時(shí)域波形。

1.由光電導(dǎo)天線構(gòu)成的THz發(fā)生器 2.拋物面鏡 3.偏置電壓 4.樣品 5.ATR晶體 6.由光電導(dǎo)天線構(gòu)成的THz探測(cè)器 7.電流探測(cè)

圖1 THz光譜儀的工作原理
Figure 1 Working principle of THz spectrometer

1.2.2 ATR的光學(xué)參數(shù) 圖2是THz-ATR檢測(cè)附件的光路示意圖。THz波在ATR晶體與樣品的緊密接觸面發(fā)生了全反射，并產(chǎn)生隱失波(evanescent wave)穿入樣品內(nèi)部，其振幅隨入射深度呈指數(shù)衰減，穿透深度dp為微米級(jí)[12]。

隱失波與樣品的相互作用使得全反射波出現(xiàn)了幅度衰減(ΔA)和相位延遲(Δφ)，可以用復(fù)折射率在頻域范圍綜合表達(dá)這些變化[13-14]。復(fù)折射率又可以用折射率和消光系數(shù)來(lái)表示[15]：

圖2 THz-ATR光學(xué)原理示意圖Figure 2 Schematic illustration of THz-ATR optics

(1)

式中：

n(ω)——被測(cè)樣品的折射率；

κ(ω)——被測(cè)樣品的消光系數(shù)。

折射率反映光在樣品中的傳播速率，消光系數(shù)表示樣品對(duì)光的吸收強(qiáng)度。復(fù)折射率能夠表征THz波對(duì)樣品成分的響應(yīng)，是被測(cè)樣品固有的光學(xué)常數(shù)，由樣品微環(huán)境 (如溫度、成分、物質(zhì)構(gòu)象、水合狀態(tài)等)決定，同儀器的相關(guān)參數(shù)(如THz波的輻射強(qiáng)度以及隱失波的穿透深度)無(wú)關(guān)[16-17]。與透射、反射模式相比，ATR模式可以更加精確測(cè)得樣品的復(fù)折射率[13, 18]。本研究使用折射率n(ω)和消光系數(shù)κ(ω)的THz光譜圖來(lái)表達(dá)樣品的復(fù)折射率。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 樣本采購(gòu)后用冷藏箱以較快速度運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將樣本中不同的組織——肌肉、脂肪和皮膚切割成2.5 cm×2.5 cm方形薄片，其中肌肉和脂肪的薄片厚度為0.5 cm，而皮膚厚度在分割前已經(jīng)較薄，且皮膚組織較為堅(jiān)硬，難于切薄，故保留皮膚組織的原始厚度，不再切薄。

1.3.2 THz光譜采集 THz光譜分析儀工作的環(huán)境溫度為(25±1) ℃，相對(duì)濕度為50%～65%，頻率分辨率為7.6 GHz，檢測(cè)頻率范圍是0.1～2.0 THz，共250個(gè)采樣頻率點(diǎn)(波點(diǎn))，樣品的譜線經(jīng)2 048次自動(dòng)掃描并平均后得到。該光譜儀自帶樣品腔，檢測(cè)過程中外接氣泵泵入干燥空氣對(duì)樣品腔除濕，以減少空氣中水汽吸收干擾THz波。

本研究用純水驗(yàn)證THz光譜分析儀在25 ℃下THz-ATR光譜數(shù)據(jù)的可靠性與有效性，因此分別采集了純水和肉樣的THz光譜。純水的檢測(cè)方法：用吸管將適量純水滴入ATR檢測(cè)窗，測(cè)量其THz光譜，檢測(cè)完畢后用濾紙將殘留的水分吸干；肉樣的檢測(cè)方法：將樣本平整放入ATR檢測(cè)窗表面，每份樣品上下兩面分別采集3次，共重復(fù)測(cè)量6次，獲得6份THz光譜數(shù)據(jù)，算術(shù)平均后獲得該樣本的最終THz光譜數(shù)據(jù)。每檢測(cè)完一份樣品后，用純水擦拭ATR檢測(cè)窗表面，去除表面殘留的油脂等，并用濾紙將殘留的水分吸干。

2 結(jié)果與分析

2.1 純水的THz光譜

純水在0.2～2.0 THz下實(shí)測(cè)的折射率和消光系數(shù)與參考值[19]的比較結(jié)果見圖3。由圖3可知，兩者的實(shí)測(cè)值和參考值基本一致?？梢?，此設(shè)備能夠可靠、準(zhǔn)確地獲得純水的THz光譜特性。

圖3 純水在0.2～2.0 THz的參考與實(shí)測(cè)折射率和消光系數(shù)Figure 3 The referenced and experimental refractive index and extinction coefficient of pure water in the 0.2～2.0 THz

2.2 不同豬肉組織的THz光譜

豬肉中不同的組織——肌肉、脂肪和皮膚的ATR時(shí)域波形圖見圖4。同空白樣以及純水的波形圖進(jìn)行比較，圖4(a)中信號(hào)的峰值或者能量從高到低依次是：空白、脂肪、皮膚、肌肉、純水。肉中各組織水分的含量從高到低依次是肌肉(70%～80%)、皮膚(60%～70%)、脂肪(10%～30%)[1]58?？梢?，豬肉組織中的水會(huì)顯著吸收入射THz波的能量，使得ATR波能量出現(xiàn)不同程度的衰減，衰減程度和組織含水量呈顯著關(guān)系，含水量越高衰減越多[7,20]。從圖4(b)波峰在時(shí)間軸上的位置可以看出，脂肪、皮膚、肌肉、純水的ATR信號(hào)和空白信號(hào)有一個(gè)明顯的相位差，而這3種組織以及純水在相位上區(qū)別相對(duì)較小?？梢?，不同組織在THz-ATR條件下主要體現(xiàn)為ATR信號(hào)的振幅衰減程度不同。

根據(jù)1.2所述，可以融合時(shí)域中幅度與相位的差異，將ATR信號(hào)進(jìn)行傅里葉變換，獲得豬肉組織在不同頻率下的折射率與消光系數(shù)，見圖5。其中，肌肉的折射率為1.9～2.5，脂肪的折射率為1.7～1.8，皮膚的折射率為1.7～2.1，與文獻(xiàn)[7～8]報(bào)道基本吻合，而3種組織的消光系數(shù)目前尚沒有研究報(bào)道。

圖4 空白、豬肉組織以及純水的THz時(shí)域光譜圖Figure 4 THz time-domain wave forms of no sample,porcine tissue and pure water

圖5 脂肪組織、皮膚組織、肌肉組織和純水的折射率和消光系數(shù)Figure 5 The refractive index and extinction coefficient of adipose, skin, muscle and pure water

從圖5中各譜線的總體位置來(lái)看，折射率和消光系數(shù)從高到低依次是純水、肌肉、皮膚、脂肪，與圖4中各樣本THz脈沖的峰值大小排序相一致?？梢姡?.2～2.0 THz測(cè)量范圍內(nèi)，各組織的水分含量會(huì)極大地影響豬肉組織的折射率和消光系數(shù)，含水量越高，折射率以及消光系數(shù)就會(huì)越大。

2.3 不同組織的光譜差異

皮膚組織的主要成分為膠原蛋白，肌肉組織的基本成分為肌纖維蛋白。蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸在THz波段有特征吸收[21]，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水鍵、氫鍵和靜電力等一系列非共價(jià)鍵對(duì)THz波也比較敏感[22]，在生物組織內(nèi)蛋白質(zhì)借助分子表面分布的極性基團(tuán)與水分子之間的靜電引力形成了水殼層結(jié)構(gòu)[23]，這些因素使得肌肉和皮膚組織對(duì)THz波吸收較強(qiáng)。動(dòng)物的脂肪主要由甘油三酯的混合物構(gòu)成，甘油三酯以脂滴的形式儲(chǔ)存于脂肪細(xì)胞中。甘油三酯是非極性分子，表面沒有羥基或氨基等親水基團(tuán)，分子周圍儲(chǔ)存的結(jié)合水很少，因此脂肪組織對(duì)THz波的吸收明顯弱于皮膚、肌肉組織[5]，主要組成分子及其結(jié)構(gòu)的不同可能是除了含水量之外造成各組織光譜信號(hào)差異的另一個(gè)重要因素。

光譜中未見有明顯的吸收峰或者特征波段，一方面是因?yàn)樨i肉組織富含水，而因水分子集體平移導(dǎo)致其對(duì)THz無(wú)特征吸收[24]，另一方面是因?yàn)樨i肉成分十分復(fù)雜，生物大分子如氨基酸[21]、多肽[25]、DNA[26]等以及生物小分子如核苷酸[27]等都會(huì)對(duì)THz波有吸收，導(dǎo)致譜線相互重疊，無(wú)法分辨出特征峰。

不論從折射率還是消光系數(shù)來(lái)看，豬肉3種組織的譜線都具有較大區(qū)別。尤其在0.2～1.6 THz的低頻段區(qū)分更明顯。皮膚與脂肪的折射率在1.6～2.0 THz頻段出現(xiàn)了重合，但是各組織的消光系數(shù)THz譜都有較好的區(qū)分度。進(jìn)一步在0.2～1.6 THz對(duì)各組織樣本的光譜數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表1、2)表明，除了脂肪和皮膚組織的折射率最小值相同以外，各組織折射率和消光系數(shù)的統(tǒng)計(jì)值均有明顯差異。其中，3種組織的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差從低至高依次是脂肪、皮膚和肌肉組織。

表1 豬肉組織折射率統(tǒng)計(jì)值Table 1 Statistical values of refractive index in pork tissues

表2 豬肉組織消光系數(shù)統(tǒng)計(jì)值Table 2 Statistical values of extinction coefficient in pork tissues

可見在低頻段，折射率或者消光系數(shù)可以作為鑒別組織類型的參數(shù)和指標(biāo)。該方法可以推廣到各種家禽(如牛、羊、雞等)組織樣本的鑒別。這是因?yàn)檫@些家禽的同類組織具有相似的化學(xué)組成，所以其THz光譜也具有相似性[9, 20]。

因此，豬肉組織的THz光譜是其組成成分在THz波段的共同表達(dá)。豬肉的品質(zhì)不同，決定品質(zhì)的生物分子也不相同，其THz光譜也會(huì)不相同。雖然無(wú)法通過特征峰來(lái)區(qū)分品質(zhì)，但是可以對(duì)光譜進(jìn)行綜合分析，建立光譜數(shù)據(jù)與品質(zhì)指標(biāo)的數(shù)學(xué)關(guān)系模型，實(shí)現(xiàn)豬肉品質(zhì)的快速無(wú)損檢測(cè)。由于不同豬肉組織的THz光譜特性有明顯差異，因此，需對(duì)同一種豬肉組織進(jìn)行THz品質(zhì)檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用THz-ATR技術(shù)，不需要復(fù)雜的預(yù)處理，就能夠獲得豬肉不同組織在THz波段下的折射率和消光系數(shù)，從而無(wú)損檢測(cè)鮮豬的肌肉、皮膚和脂肪組織。本研究表明：含水量是影響新鮮組織對(duì)THz波吸收的主要因素，在0.2～1.6 THz 低頻段下，豬肉不同組織的THz光譜區(qū)分較明顯。雖然本研究的試驗(yàn)樣本來(lái)自單一主體，要給出定量的結(jié)論尚需進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)，但仍然可以看出用THz-ATR技術(shù)無(wú)損鑒別組織類型是可行的；可以預(yù)見，在對(duì)同一種豬肉組織取樣的前提下，能夠通過建立各樣本的THz光譜與豬肉品質(zhì)的關(guān)系數(shù)學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)豬肉品質(zhì)的無(wú)損檢測(cè)。

[1] 孔保華, 馬麗珍.肉品科學(xué)與技術(shù)[M].北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2003.

[2] 楊智靈, 李濤, 任保增.近紅外光譜技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的最新研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械, 2013, 29(5): 237-240.

[3] 王龍, 朱榮光, 段宏偉, 等.光學(xué)快速分析技術(shù)在食品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(3): 235-238.

[4] 齊亮, 趙婕, 趙茂程.冷鮮豬肉的新鮮度無(wú)損檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及THz檢測(cè)技術(shù)展望[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(9): 219-224.

[5] WANG Yu-ye, MINAMIDE H, TANG Ming, et al.Study of water concentration measurement in thin tissues with terahertz-wave parametric source[J].Optics Express, 2010, 18(15): 15 504-15 512.

[6] 郭力菡, 王新柯, 張巖.生物組織的太赫茲數(shù)字全息成像[J].光學(xué)精密工程, 2017, 25(3): 611-615.

[7] HOSHINA H, HAYASHI A, MIYOSHI N, et al.Terahertz pulsed imaging of frozen biological tissues[J].Applied Physics Letters, 2009, 94(12): 1-3.

[8] HE Yue-zhi, UNG B S, PARROTT E P, et al.Freeze-thaw hysteresis effects in terahertz imaging of biomedical tissues[J].Biomedical Optics Express, 2016, 7(11): 4 711-4 717.

[9] WILMINK G J, IBEY B L, TONGUE T, et al.Development of a compact terahertz time-domain spectrometer for the measurement of the optical properties of biological tissues[J].Journal of Biomedical Optics, 2011, 16(4): 1-10.

[10] KIM Y, YEE D S.High-speed terahertz time-domain spectroscopy based on electronically controlled optical sampling[J].Optics Letters, 2010, 35(22): 3 715-3 717.

[11] 劉龍海, 謝劍華, 陳媚媚, 等.太赫茲時(shí)域光譜成像系統(tǒng)及其檢測(cè)應(yīng)用[J].光電產(chǎn)品與資訊, 2015(9): 22-24.

[12] 翁詩(shī)甫.傅里葉變換紅外光譜分析[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010: 157-159.

[13] NAGAI M, YADA H, ARIKAWA T, et al.Terahertz time-domain attenuated total reflection spectroscopy in water and biological solution[J].International Journal of Infrared and Millimeter Waves, 2006, 27(4): 505-515.

[14] SHIRAGA K, OGAWA Y, KONDO N, et al.Evaluation of the hydration state of saccharides using terahertz time-domain attenuated total reflection spectroscopy[J].Food Chemistry, 2013, 140(1/2): 315-320.

[15] SMYE S W, CHAMBERLAIN J M, FITZGERALD A J, et al.The interaction between Terahertz radiation and biological tissue[J].Physics in Medicine & Biology, 2001, 46(9): 101-110.

[16] MARKELZ A G.Terahertz dielectric sensitivity to biomolecu-lar structure and function[J].IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 2008, 14(1): 180-190.

[17] HIRORI H, YAMASHITA K, NAGAI M, et al.Attenuated total reflection spectroscopy in time domain using terahertz coherent pulses[J].Japanese Journal of Applied Physics Part 2: Letters & Express Letters, 2004, 43(10A): L1 287-L1 289.

[18] JEPSEN P U, COOKE D G, KOCH M.Terahertz spectros-copy and imaging-Modern techniques and applications[J].Laser and Photonics Reviews, 2011, 5(1): 124-166.

[19] PALIK E D.Handbook of optical constants of solids II[M].California: Academic Press, 1991: 1 067-1 077.

[20] HE Ming-xia, AZAD A K, YE Sheng-hua, et al.Far-infrared signature of animal tissues characterized by terahertz time-domain spectroscopy[J].Optics Communications, 2006, 259(1): 389-392.

[21] LI Zhi, GUAN Ai-hong, GE Hong-yi, et al.Wavelength selection of amino acid THz absorption spectra for quantitative analysis by a self-adaptive genetic algorithm and comparison with mwPLS[J].Microchemical Journal, 2017, 132: 185-189.

[22] MERNEA M, CALBOREAN O, GRIGORE O, et al.Validation of protein structural models using THz spectroscopy: a promising approach to solve three-dimensional structures[J].Optical & Quantum Electronics, 2014, 46(4): 505-514.

[23] Ebbinghaus S, Kim S, Heyden M, et al.An extended dynami-cal hydration shell around proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(52): 20 749-20 752.

[24] 劉暢, 岳凌月, 王新柯, 等.利用太赫茲反射式時(shí)域光譜系統(tǒng)測(cè)量有機(jī)溶劑的光學(xué)參數(shù)[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2012, 32(6): 1 471-1 475.

[25] ZHANG Ming-kun, WEI Dong-shan, TANG Ming-jie, et al.Molecular dynamics simulations of conformation and chain length dependent terahertz spectra of alanine polypeptides[J].Molecular Simulation, 2016, 42(5): 1-7.

[26] ZHANG Wei, BROWN E R, RAHMAN M, et al.Observation of terahertz absorption signatures in microliter DNA solutions[J].Applied Physics Letters, 2013, 102(2): 219-222.

[27] SHEN Y C, UPADHYA P C, LINFIELD E H, et al.Tempera-ture-dependent low-frequency vibrational spectra of purine and adenine[J].Applied Physics Letters, 2003, 82(14): 2 350-2 352.