付 雪，隋 琳，吳巧麗，谷 偉，錢(qián) 方

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

0 引言

乳糖酶即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（β-D-galactoside galacto-hydrolase），是一類(lèi)催化特殊類(lèi)型糖苷鍵-β-半乳糖苷類(lèi)化合物中β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解斷裂的酶[1]。它廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，用乳糖酶水解牛乳中乳糖可以滿足乳糖不適癥患者需要，還可提高乳制品甜度，減少甜味劑用量；可防止冷凍乳制品易結(jié)晶析出；用乳糖水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等[2-6]。但由于乳糖酶成本過(guò)高等因素制約了其應(yīng)用。而固定化乳糖酶可以反復(fù)使用，且能縮短時(shí)間、節(jié)約成本，同時(shí)固定化乳糖酶對(duì)酸、堿有較強(qiáng)的耐受力，熱穩(wěn)定性也較好。國(guó)外已有相當(dāng)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)固定化乳糖酶[7]。殼聚糖是由廣泛存在于自然界的幾丁質(zhì)脫乙酰得到的一種天然高分子生物材料，因其相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)所關(guān)注，在很多領(lǐng)域已經(jīng)取得了進(jìn)展，而在固定化酶并保持酶活性方面有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。2004年，毛跟年等人[8]研究了強(qiáng)化海藻酸鈣固定化β-半乳糖苷酶的方法及固定化酶的性質(zhì)，并用于制備低聚半乳糖。2006年，潘曉亞等人[9]以明膠為載體包埋固定乳糖酶，優(yōu)化了固定化條件。2011年，錢(qián)婷婷等人[10]用改性磁性殼聚糖微球固定乳糖酶。與前人研究不同的是試驗(yàn)考慮到食品安全選擇食品安全級(jí)的殼聚糖為載體固定乳糖酶，研究其固定化酶的優(yōu)化條件。

1 試驗(yàn)方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）食品級(jí)，大連鑫蝶甲殼素有限公司提供；乳糖酶（3 000 L HP-G），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司提供；血糖測(cè)定試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑公司提供；鄰硝基酚（ONP）、鄰硝基酚-β-半乳糖苷（ONPG）、戊二醛、磷酸氫二鉀等。

1.2 儀器

pHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；722型光柵可見(jiàn)分光光度計(jì)，山東高密彩虹分析儀器有限公司產(chǎn)品；UV-1900型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 方法

（1）殼聚糖載體制備[11]。將質(zhì)量濃度20.0 g/L殼聚糖溶液滴入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，液滴剛滴入凝結(jié)液時(shí)不攪拌，即得殼聚糖載體，取殼聚糖載體0.2 g進(jìn)行固定化條件研究。

（2） 乳糖酶活力測(cè)定。采用ONPG法[12]。

（3） 酶活力回收率[13]。

式中：U1——固定化酶總活力，U/g；

U2——加入游離酶總活力，U/g。

（4）蛋白含量的測(cè)定。采用紫外吸收法[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化順序確定

酶固定化方法分2種：一種是先將載體與酶作用，再用戊二醛交聯(lián)（即先固定后交聯(lián)）；另一種是載體先經(jīng)戊二醛活化后，再與酶作用（即先交聯(lián)后固定）。為達(dá)到更好的固定化乳糖酶效果，研究了固定化順序?qū)θ樘敲富盍Φ挠绊憽?/p>

固定化順序?qū)潭ɑЧ挠绊懸?jiàn)圖1。

圖1 固定化順序?qū)潭ɑЧ挠绊?/p>

由圖1可知，先交聯(lián)后固定法制得固定化乳糖酶活力為0.495 U/g，而先固定后交聯(lián)法制得固定化乳糖酶活力僅為0.018 U/g。可見(jiàn)，載體經(jīng)過(guò)戊二醛交聯(lián)活化后可以與酶牢固結(jié)合。

2.2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定

戊二醛是雙官能團(tuán)試劑，既是交聯(lián)劑又是蛋白質(zhì)變性劑[15]。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，沒(méi)能將足夠的酶交聯(lián)到載體上；而戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高時(shí)，戊二醛作為變性劑又能使酶失活。所以，研究戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力影響，以期達(dá)到最高固定化酶活力。

戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響

由圖2可知，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%時(shí)，固定化乳糖酶活力最高，乳糖酶活力回收率為2.08%。當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.4%時(shí)，殼聚糖載體上活性基團(tuán)相對(duì)較少，固定化乳糖酶活力較低，殼聚糖分子中被活化氨基數(shù)量隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，故固定化乳糖酶活力也升高；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.4%時(shí)，殼聚糖載體上形成過(guò)多的活性醛基，導(dǎo)致酶分子與載體之間形成多點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)障礙，使酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，固定化乳糖酶活力則有所下降。因此，選擇戊二醛適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，此時(shí)固定化酶活力最大。

2.3 戊二醛用量確定

戊二醛用量對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 戊二醛用量對(duì)固定化酶活力的影響

由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%戊二醛溶液用量為1.5 mL時(shí)，固定化乳糖酶活力最高。當(dāng)戊二醛用量少于1.5 mL時(shí)，固定化乳糖酶活力隨著戊二醛用量的增加而升高；當(dāng)高于1.5 mL時(shí)，固定隨著戊二醛用量的增加而降低。因此，選擇戊二醛適宜用量為1.5 mL，此時(shí)固定化酶活力最大。

2.4 交聯(lián)溫度確定

交聯(lián)溫度影響載體的活化程度，也直接影響載體與酶的固定。

交聯(lián)溫度對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 交聯(lián)溫度對(duì)固定化酶活力的影響

由圖4可知，4℃低溫時(shí)固定化乳糖酶活力較低，說(shuō)明低溫不利于乳糖酶與殼聚糖載體的交聯(lián)；隨著交聯(lián)溫度的升高，固定化乳糖酶活力逐漸增大；當(dāng)交聯(lián)溫度達(dá)到30℃時(shí)，固定化乳糖酶活力最高；當(dāng)交聯(lián)溫度高于30℃時(shí)，固定化乳糖酶活力開(kāi)始迅速下降，這可能是由于溫度升高使得游離乳糖酶的活力有所降低。因此，選擇30℃作為交聯(lián)溫度。

2.5 交聯(lián)時(shí)間確定

交聯(lián)時(shí)間即戊二醛與殼聚糖載體接觸時(shí)間，也是載體被活化的時(shí)間，也影響固定化酶活力。

交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

由圖5可知，固定化乳糖酶活力隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；當(dāng)交聯(lián)時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)，固定化乳糖酶活力最高；交聯(lián)時(shí)間超過(guò)16 h，固定化乳糖酶活力迅速下降，24 h時(shí)酶活下降了10%?？赡苡捎谖於?duì)酶有一定變性作用，隨著交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)，固定化乳糖酶活力有所下降。因此選擇交聯(lián)時(shí)間為16 h。

2.6 交聯(lián)pH值確定

酶分子本身帶有許多氨基酸殘基，氨基酸殘基包括酸性和堿性，所以pH值變化會(huì)影響殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響底物的結(jié)合和催化反應(yīng)。

交聯(lián)pH值對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖6。

圖6 交聯(lián)pH值對(duì)固定化酶活力的影響

由圖6可知，固定化會(huì)影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶活力。隨著交聯(lián)pH值的增加，固定化乳糖酶的活力逐漸增大；當(dāng)pH值為7時(shí)，固定化乳糖酶活力達(dá)到最高；當(dāng)pH值為8時(shí)，固定化乳糖酶活力又有所下降。因此，選擇pH值為7作為交聯(lián)pH值。

2.7 固定化溫度確定

固定化溫度對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖7。

圖7 固定化溫度對(duì)固定化酶活力的影響

由圖7可知，固定化溫度對(duì)固定化乳糖酶活力的影響較大。4℃固定時(shí)，固定化乳糖酶活力最高；當(dāng)固定化溫度由20℃升高到40℃時(shí)，固定化乳糖酶活力隨著固定化溫度的升高而迅速下降。因此，選擇4℃作為乳糖酶的固定化溫度。

2.8 固定化時(shí)間確定

固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響見(jiàn)圖8。

圖8 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

由圖8可知，當(dāng)固定化時(shí)間少于9 h時(shí)，固定化乳糖酶活力隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；當(dāng)固定化時(shí)間達(dá)到9 h時(shí)，固定化乳糖酶活力達(dá)到最大；當(dāng)固定化時(shí)間大于9 h，固定化乳糖酶活力迅速下降，這可能是由于固定化時(shí)間延長(zhǎng)，固定在載體上的乳糖酶量越多，造成載體上結(jié)合酶的空間位阻，使固定化乳糖酶活力下降。因此，選擇9 h作為乳糖酶固定化時(shí)間。

2.9 乳糖酶用量確定

乳糖酶用量對(duì)固定化效果的影響見(jiàn)圖9。

圖9 乳糖酶用量對(duì)固定化效果的影響

由圖9可知，當(dāng)乳糖酶用量為2.0 mL時(shí)，固定化乳糖酶活力達(dá)到最高；當(dāng)酶用量多于2.0 mL時(shí)，固定化乳糖酶活力迅速降低?？梢?jiàn)，定量球形殼聚糖其活性基團(tuán)是一定的，在結(jié)合位點(diǎn)未飽和前，固定化乳糖酶活性隨著用量的增加而升高，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)飽和后，增加乳糖酶用量不能提高固定化酶活力，反而使其固定化乳糖酶活力下降。試驗(yàn)表明，當(dāng)乳糖酶用量為2.0 mL時(shí)，固定化乳糖酶活力最高，此時(shí)酶活力回收率為1.94%。

2.10 最優(yōu)條件下固定化乳糖酶活力

將1.0 g殼聚糖載體（前面是0.2 g載體） 先用0.4%戊二醛溶液7.5 mL，于30℃條件下交聯(lián)16 h；再用1.0%乳糖酶溶液10.0 mL，于4℃條件下固定9 h，此條件下制得的固定化乳糖酶活力為0.735 U/g，酶活力回收率為2.45%。

3 結(jié)論

研究表明，用先交聯(lián)后固定的固定化方法可將乳糖酶很好地固定在殼聚糖載體上，即先用戊二醛交聯(lián)使殼聚糖載體活化，后將殼聚糖載體與乳糖酶進(jìn)行固定制備固定化乳糖酶。將1.0 g殼聚糖載體先用0.4%戊二醛溶液7.5 mL，于30℃條件下交聯(lián)16 h；再用10 mL 1.0%乳糖酶溶液于4℃條件下固定9 h，此條件下制得的固定化乳糖酶活力為0.735 U/g。

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