王國蕊

逄錦龍2

張德蒙2

李 昉1,2

(1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266000；2.青島明月海藻集團有限公司海藻活性物質國家重點實驗室，山東 青島 266400)

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)隸屬于紅藻門杉藻目江蘺屬，多生長于潮間帶至潮下帶的半埋于覆蓋有沙的巖石上[1]。目前已從龍須菜中分離出多種化合物[2-3]，具有調節(jié)免疫、抗腫瘤[4-5]、抗病毒、抗突變[6]、抗凝血、抗氧化[5]、抗菌等多種生理活性及藥用功能[7]。但對龍須菜揮發(fā)油的成分以及抗菌活性研究還相對較少，對龍須菜揮發(fā)油的抗鹵蟲活性也未見報道。

值得關注的是潮間帶海藻的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分具有很好的抗菌和抗氧化等活性，可用于開發(fā)藥品或者保健品[8]。同時，同種植物的揮發(fā)油用不同的方法提取在成分以及活性方面有較大差異[9]。因此本研究以龍須菜為對象，利用氣相色譜-質譜分析方法對比不同提取方法得到的揮發(fā)油成分，分析揮發(fā)油主體成分，并研究比較2種揮發(fā)油對幾種常見致病菌抗菌作用以及對鹵蟲殺蟲活性的差異，旨在探索龍須菜揮發(fā)油的最佳提取方法，并為擴展大型紅藻龍須菜的應用范圍提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

龍須菜：于2016年5月采于山東威海養(yǎng)殖場；

大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)：中國水產科學研究院黃海水產研究所；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

氣相質譜聯用儀：GCMS-QP2010型，日本島津公司；

旋轉蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-95B型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

冷凍干燥機：FD-1A-80型，上海比朗儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 直接水蒸氣蒸餾法 將1 kg新鮮龍須菜冷凍干燥，粉碎，對龍須菜粉末直接進行水蒸氣蒸餾得龍須菜揮發(fā)油(D-GLS)，用重蒸二氯甲烷萃取，密封待測。

1.2.2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法 將1 kg新鮮龍須菜晾干至恒重，粉碎，浸泡于等體積重蒸甲醇中，提取3次，超聲輔助、浸提均為24 h，將浸提液于減壓旋轉蒸發(fā)器中蒸干，得龍須菜粗提物浸膏。最后對粗提物浸膏進行水蒸氣蒸餾得到龍須菜揮發(fā)油(S-GLS)，用重蒸二氯甲烷萃取，密封待測。

1.2.3 GC-MS分析條件

(1) 氣相色譜條件：柱箱溫度50 ℃，進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL，不分流，進樣時間1 min；載氣He，壓力100 kPa，總流量50 mL/min，柱流量1.69 mL/min；柱溫從50 ℃開始，維持0 min，以5 ℃/min升溫到220 ℃，維持5 min，再以5 ℃/min升溫到300 ℃，維持0 min。

(2) 質譜條件：EI離子源，電離源(70 eV)，離子源溫度200 ℃，接口溫度300 ℃，溶劑延遲時間3 min，質量數掃描范圍為35～500m/z。

1.2.4 化合物結構與含量分析 利用儀器自帶譜庫進行檢索，確定化合物結構，只報道相似度>80%的物質，采用色譜峰面積歸一化法確定各組分相對含量，用百分比表示。

1.2.5 抗菌試驗 將D-GLS揮發(fā)油和S-GLS揮發(fā)油分別用色譜甲醇溶解，濃度均為10 mg/mL，陽性對照為4 mg/mL阿莫西林的二甲基亞砜(DMSO)溶液。各取樣品5 μL到濾紙片(直徑6 mm)，晾干，貼到涂菌的LB固體平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小。按式(1)計算抑菌率。

(1)

式中：

c——抑菌率，%；

d0——濾紙片直徑，mm；

d1——供試樣品抑菌圈直徑，mm；

d2——陽性對照，mm。

1.2.6 抗鹵蟲活性試驗 參照李昉等[10]的方法，取190 μL鹵蟲幼蟲懸浮液，加入到96孔板中，每孔鹵蟲控制在16條左右。用DMSO將兩種揮發(fā)油配制成梯度溶液，每孔加入樣品10 μL，使其最終濃度分別為0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20 mg/mL，并設置海水和DMSO對照，每個樣品做6個平行。在25 ℃下培養(yǎng)24 h，記錄鹵蟲死亡個數，計算死亡率和半致死濃度LD50。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法的龍須菜揮發(fā)性成分

根據水蒸氣蒸餾法得到的D-GLS揮發(fā)油，經GC-MS分析后得龍須菜揮發(fā)油總離子流色譜圖(圖1)，該方法得到的揮發(fā)油組分在3.085 min開始出峰并且在25～35 min集中出峰，由表1可知，共得到68種成分，包括烷烴20種、烯烴6種、醛類9種、醇類12種、酮類3種、羧酸及酯15種和其它化合物3種。其中相對含量>5%的化合物依次有：2-辛烯醛(22.29%)、二十烷(18.84%)、4-亞乙烯基環(huán)己烯(7.81%)和1-辛烯-3-醇(6.91%)。而采用溶劑提取-水蒸氣蒸餾法得到的S-GLS揮發(fā)油，經GC-MS分析后得龍須菜揮發(fā)油總離子流色譜圖(圖2)，該方法得到的揮發(fā)油組分出峰時間集中在20～35 min，由表2可知，共得到56種成分，包括烷烴20種、醛類1種、醇類6種、酮類2種、羧酸及酯17種和其它化合物10種。其中相對含量>5%的化合物有：二十烷(37.41%)和棕櫚酸甲酯(6.89%)。由圖3可知，S-GLS揮發(fā)油相對于D-GLS揮發(fā)油，其醛類成分由24.69%下降至0.2%，羧酸及酯類成分由9.02%提高至21.54%，在一定程度上說明，直接水蒸氣蒸餾揮發(fā)油成分可能會導致羧酸氧化，醛類成分增加。總體來看，烴類和羰基類化合物是龍須菜揮發(fā)油的主體成分。

圖1 直接水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分GC-MS譜圖Figure 1 TIC chromatograms of volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with direct steam distillation

圖2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分GC-MS譜圖Figure 2 TIC chromatograms of volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with solvent extraction-steam distillation

2.2 對龍須菜揮發(fā)油主體成分解析

2.2.1 烴類化合物 由圖3可知，烴類化合物是龍須菜揮發(fā)油的最主要成分，嗅覺閾值多數較高，對揮發(fā)油的氣味貢獻不大。直接水蒸氣蒸餾法和溶劑提取-水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中烷烴含量分別為38.98%和60.01%，另外直接水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中還有10.41%的烯烴，其中角鯊烯是一種直鏈三萜化合物，具有類似紅細胞攝氧功能，可生成活化的氧化角鯊烯，促進新陳代謝，提高機體免疫力，因而常作為功效成分添加于保健食品中[11]。2種方法提取的揮發(fā)油中飽和烷烴均是其主要物質，而徐年軍等[12]所得龍須菜揮發(fā)油的結果是以烯烴(61.67%)為主要成分，可能與龍須菜的生長季節(jié)、龍須菜揮發(fā)性物質的提取方法和檢測條件有關。

表1 直接水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分Table 1 Volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with direct steam distillation

表2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分Table 2 Volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with solvent extraction-steam distillation

圖3 2種提取方法所得龍須菜揮發(fā)油組成與含量Figure 3 The volatile oil composition and content from two extraction methods in G.Lemaneiformis

2.2.2 醛類化合物 醛類化合物主要是脂肪氧化的產物[13]，具有較低的嗅覺閾值，是揮發(fā)油氣味的主要來源。由表1和圖3可知，直接水蒸氣蒸餾法醛類含量為24.69%。其中2-辛烯醛含量最高(為22.29%)，其嗅覺閾值非常低(3 μg/kg)，具有脂肪和黃瓜味[14]，是氣味的主要貢獻者。還檢測出2,6-壬二烯醛、2,4-庚二烯醛、正己醛、庚醛和十四醛，通常會呈現出辛辣和令人不愉快的腥味、脂肪味、草味等刺激性味道[15]。而溶劑提取-水蒸氣蒸餾法只檢測到0.2%的2-甲基-5-異丙烯基環(huán)戊-1-烯甲醛，大大降低了揮發(fā)油的不良氣味。

2.2.3 醇類化合物 醇類化合物相比于醛類一般嗅覺閾值較高。由表1和圖3可知，直接水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中醇類含量為14.78%，其中1-辛烯-3-醇為6.91%，且嗅覺閾值較低(10 μg/kg)[16]，具有類似蘑菇香氣和泥土味[17]。葉綠醇是雙萜類化合物，具有花香和脂香氣，是合成維生素K及維生素E的原料，具有一定的抗氧化作用[18]。由表2和圖3可知，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中只有8.37%，多為嗅覺閾值更高的飽和醇，而具有抗氧化作用的葉綠醇含量從1.15% 提高到3.17%。

2.2.4 酮類化合物 酮類化合物是由于不飽和脂肪熱氧化和氨基酸降解，嗅覺閾值比醛類高[19-20]。由表1、2可知，2種方法均檢測出少量β-紫羅蘭酮和植酮。β-紫羅蘭酮為萜類物質，在一些海洋真菌和藻類中都有存在[21-22]，具有紫羅蘭香和木香，有抗真菌作用，此外還具有較強的抑癌作用[23-24]。

2.2.5 羧酸及酯類化合物 由圖3可知，羧酸及酯類化合物相比于直接水蒸氣蒸餾法，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法使羧酸及酯類含量從9.02%提高到21.54%。由表1、2可知，2種揮發(fā)油中都檢測出包括花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)等多種多不飽和脂肪酸(PUFAs)，PUFAs對人體有非常重要的生理功能，可以調節(jié)人體脂質代謝、增加血管彈性、降血壓、降血脂、預防心腦血管疾病，促進生長發(fā)育，此外對抗癌、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、調節(jié)免疫、延緩衰老、減肥、美容等方面均具有重要的生理作用[25-26]。

2.3 龍須菜揮發(fā)油抗菌作用

由表3可知，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油在濃度為10 mg/mL條件下對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157、沙門氏菌和副溶血性弧菌均有一定抗菌作用，且抑菌作用均優(yōu)于直接水蒸氣蒸餾法的，抑菌效果為副溶血性弧菌>單增李斯特菌>沙門氏菌>大腸桿菌O157>金黃色葡萄球菌，其中對副溶血性弧菌抑菌率最高，可達17.69%。

表3 龍須菜揮發(fā)油的抑菌作用Table 3 The bacteriostatic action of volatile oil in G.Lemaneiformis

2.4 龍須菜揮發(fā)油抗鹵蟲活性

由圖4可知，隨著濃度的升高，揮發(fā)油對鹵蟲的殺蟲活性明顯增強。在相同濃度條件下，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油的殺蟲活性均高于直接水蒸氣蒸餾法的。2種揮發(fā)油在0.16 mg/mL的濃度條件下，對鹵蟲的致死率均超過50%。

由圖4數據可模擬計算，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油和直接水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油對鹵蟲LD50分別為0.126，0.162 mg/mL，且2種揮發(fā)油殺蟲活性要明顯高于敵敵畏、氯氰菊酯和氧樂果3種常見化學農藥的[12]。

圖4 龍須菜揮發(fā)油的殺蟲活性結果Figure 4 The insecticidal activities of volatile oil in G.Lemaneiformis

3 結論

(1) 相比于直接水蒸氣蒸餾法，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法得龍須菜揮發(fā)油營養(yǎng)價值較高，含有較高的羧酸及酯類。提取方法對揮發(fā)油成分產生明顯影響。

(2) 龍須菜揮發(fā)油具有一定的廣譜抗菌能力和較好的殺蟲活性。溶劑提取-水蒸氣蒸餾法是獲得高活性龍須菜揮發(fā)油的有效方法。

(3) 本研究所得龍須菜揮發(fā)油對鹵蟲有較強的殺蟲活性，證明該揮發(fā)油具有作為生物農藥的可能，為擴展大型紅藻龍須菜的應用范圍提供了一定理論依據。由于尚未明確揮發(fā)油中抗蟲抗菌的活性物質是哪些單體化合物及可能的機理，今后需要在這些方面繼續(xù)深入開展研究工作。

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