李明 李璽 權(quán)乾坤 袁海峰 徐陽

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710004；2. 西安市第五醫(yī)院, 陜西 西安 710083)

老年性癡呆是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性變性疾病。有研究表明，老年大鼠海馬突觸數(shù)量和突觸素(Synaptophysin,SYN)表達(dá)明顯減少[1]，在老年癡呆患者早期即可出現(xiàn)突觸的喪失，其認(rèn)知障礙程度與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。因此，突觸的病理性重構(gòu)是老年性癡呆認(rèn)識障礙的重要病理基礎(chǔ)[2-4]。研究表明，老年大鼠腦內(nèi)突觸素丟失程度與記憶缺失程度呈正相關(guān)[5]。

人參皂甙Rg1是人參“益智延年”的主要成分, 其主要的靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近年來，人參皂苷Rg1對神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)記憶和抗衰老作用方面的研究已取得了一定進(jìn)展[6]，已成為研究中藥抗癡呆的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1對多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶障礙均有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與提高膽堿能功能，促進(jìn)M-膽堿受體數(shù)量明顯增加、促進(jìn)受體蛋白合成有關(guān)[7]。人參皂甙Rg1還有抗氧化，清除自由基，抗衰老和抑制細(xì)胞凋亡的作用[8-10]。但是目前關(guān)于人參皂甙Rg1對SYN表達(dá)是否有上調(diào)作用并不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)采用岡田酸(okadaic acid，OA)制備老年癡呆大鼠腦片模型，觀察人參皂苷Rg1對老年癡呆模型大鼠腦片中SYN表達(dá)的影響，旨在闡明人參皂苷Rg1能否通過影響突觸素的活性表達(dá)，發(fā)揮抗老年性癡呆神經(jīng)退行性變的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重110～130g雄性 SD大鼠,5周齡，清潔級，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號為SCXK(陜)2007-001。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》。

1.1.2 主要儀器 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，型號：BH22；冰凍切片機(jī)，德國MICROM公司產(chǎn)品，型號：HM500；振動(dòng)切片機(jī)，上海之信儀器有限公司產(chǎn)品，型號：ZQP-86；圖像處理與分析系統(tǒng)，德國LEICA公司產(chǎn)品，型號：Qwin550CW。

1.1.3藥物與試劑 人參皂苷Rg1購自吉林宏久生物科技股份有限公司，分子式為C42H72O14,化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，純度98.99%，使用前溶于分析純甲醇。OA購自美國ALEXIS生物制劑公司，純度98%，使用前溶于10% 二甲基亞砜(dimethy sulphoxide, DMSO)，配制成1 mg/mL二甲亞砜溶液待用。SYN蛋白兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒(SABC)及DAB均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Haws’S蘇木素由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

圖1 人參皂苷Rg1分子結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 The chemical structural formula of Gensenoside Rg1

1.2 方法

1.2.1 腦片制備 配置人工腦脊液(成分：mmol·L-1)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) ，取5周齡SD大鼠，參照文獻(xiàn)方法[11]，大鼠經(jīng)6%水合氯醛麻醉后，斷頭取腦，快速置于0～4 ℃的人工腦脊液冰水混合物中，振動(dòng)切片機(jī)以振幅8檔，速度3檔行冠狀切片所切腦片含皮層和海馬，平均厚度400μm。挑選形態(tài)較好(含海馬和皮層)的腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養(yǎng)，溫度(32.0±0.5)℃，整個(gè)過程人工腦脊液中持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5%CO2)。

1.2.2 分組及干預(yù) 腦片隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高濃度組，每組10張腦片。人工腦脊液孵育1小時(shí)，人參皂苷Rg1各組分別加入人參皂苷Rg1(60 μmol·L-1、120 μmol·L-1、240 μmol·L-1)培養(yǎng)2 h，模型組和人參皂苷Rg1各濃度組分別加入OA(1 μmol·L-1)培養(yǎng)3 h后，固定處理。

1.2.3 腦片SYN表達(dá)檢測 標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，取出，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰凍切片，切片10μm厚，每張切片含皮層、海馬、齒狀回。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，組織切片經(jīng)抗原修復(fù), 3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min, 兔抗大鼠SYN濃度為1:600, 4℃過夜,生物素標(biāo)記的單克隆小鼠抗兔IgG即用型二抗和SABC試劑各在室溫下作用30 min, 鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物進(jìn)行抗原修復(fù)，最后DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染, PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.4 圖象分析 采用圖象處理與分析系統(tǒng)，檢測陽性反應(yīng)物質(zhì)的平均灰度值，每張切片同一區(qū)域中，隨機(jī)選取6個(gè)視野，檢測面積相同，取其平均值作為該切片目標(biāo)區(qū)域的平均灰度值?；叶戎翟降?，蛋白表達(dá)量越高，反之灰度值越高，蛋白表達(dá)量越低。

2 結(jié)果

SYN的陽性免疫反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色，主要分布于細(xì)胞的突觸、胞膜和胞漿，胞核不著色或著色淡。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠腦片經(jīng)岡田酸孵育后，模型組與空白組比較，SYN的陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后檢測腦片SYN的陽性細(xì)胞表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各濃度藥物組SYN的陽性細(xì)胞表達(dá)量均有增加(P<0.05)，其中低劑量組與中劑量組在CA1和Cortex之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)在各腦區(qū)人參皂甙Rg1高劑量組SYN的陽性細(xì)胞表達(dá)明顯優(yōu)于人參皂甙Rg1中、低劑量組，存在一定的劑量依賴關(guān)系，見表1、圖2。

表1 人參皂甙Rg1對老年癡呆模型大鼠腦片SYN的影響(灰度值)Table 1 Expression of SYN protein in rat brain slices in different groups

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與高劑量組間比較，③P<0.05；與中劑量組比較，④P<0.05

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦片皮層區(qū)SYN蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)(光學(xué)顯微鏡，×400)Figure 2 Expression of SYN protein in cortex in different groups observed by immunohistochemical method注：A. 空白組； B. 模型組； C. 人參皂甙Rg1高濃度組

3 討論

突觸素是突觸小泡中含量最多的特異性膜通道蛋白，在所有的神經(jīng)末梢內(nèi)幾乎都有分布,是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記物。它在突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)、再循環(huán)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸的發(fā)生和發(fā)育，以及突觸的可塑性中都具有非常重要的作用，是學(xué)習(xí)記憶過程中的重要蛋白[12-13]。突觸素分布數(shù)量和密度可間接反映突觸的數(shù)量和密度[14]。突觸喪失將會引起嚴(yán)重的認(rèn)知障礙,學(xué)習(xí)記憶功能受損[15]。因此，免疫組化圖像采集及數(shù)據(jù)分析能反映神經(jīng)元突觸變化狀況。本實(shí)驗(yàn)將岡田酸加入培養(yǎng)大鼠腦片的ACSF中結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組SYN蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞量下降(P<0.05) ,推測可能是岡田酸造成大鼠腦片神經(jīng)元變性壞死,導(dǎo)致軸突終末變性、丟失，突觸數(shù)量及突觸素表達(dá)的降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。

人參皂苷 Rg1 作為人參促智作用的主要有效成份之一，對 AD 具有多種神經(jīng)保護(hù)作用[17-21]。目前還未有研究證實(shí)人參皂苷 Rg1 是否可以通過上調(diào)腦內(nèi)SYN表達(dá)在突觸的可塑性中起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)在ACSF中首先加入人參皂苷Rg1預(yù)處理2 h,然后再加入岡田酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1各組腦片SYN蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組顯著提高(P<0.05)。這說明人參皂苷Rg1可能通過對抗岡田酸對SYN的抑制作用, 上調(diào)SYN的蛋白表達(dá)水平，且表達(dá)隨劑量的增加而增加,人參皂苷Rg1藥效作用呈一定的劑量依賴關(guān)系。

總之，人參皂苷 Rg1對OA所致AD大鼠腦片有明顯的干預(yù)作用,這種作用可能與人參皂苷 Rg1提高腦片突觸素的陽性表達(dá)、增加神經(jīng)元保護(hù)有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本文結(jié)果顯示，以O(shè)A誘導(dǎo)大鼠腦片tau蛋白發(fā)生磷酸化，制備AD樣tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型，經(jīng)人參皂苷Rg1預(yù)處理后，SYN的陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加且呈劑量依賴關(guān)系。由此可見，人參皂苷Rg1通過上調(diào)腦內(nèi)SYN的表達(dá)，增加神經(jīng)元保護(hù)，以此發(fā)揮抗癡呆作用。

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