涂云飛，楊秀芳，孔俊豪

(1.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310016；2.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016)

“紫娟”源于云南大葉群體國家級茶樹良種，屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)茶[CamelliaSinensis(L.) O.Kuntze]中的普洱茶變種(Camelliasinensisvar.Assamica)，是云南大葉群體種中的一種稀有茶樹品種[1]。原花青素(Proanthocyanidins或Procyanidins,簡稱PC)，主要分布在植物界中，由黃烷醇類化合物單體通過C4—C6或C4—C8共價結(jié)合而形成的一類聚合物(圖1)，是植物中廣泛存在的一大類雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱。這類物質(zhì)在酸性條件下加熱可生成紅色的花青素，因而得名。低聚原花青素(2～4個聚合體)的生物適應(yīng)性好，生物利用度高，毒性很低，具有抗氧化與清除自由基、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)，有益于心血管健康，可改善餐后動脈粥樣硬化風(fēng)險指數(shù)、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防與治療癌癥、糖尿病等作用[2-3]。有研究表明，“紫娟”茶中花青素的含量約是普通茶葉的20倍，但從“紫娟”茶葉中提取原花青素報道較少。鑒于此，筆者通過溶劑提取法從“紫娟”茶中提取出原花青素并探究了其原花青素的平均聚合度。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑Waters高效液相色譜儀[1525雙元泵，2487雙波長紫外可見檢測器，717-plus 自動進(jìn)樣器，Breeze操作控制軟件，沃特世科技(上海)有限公司]；紫外可見分光光度計 (尤尼柯上海儀器有限公司)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)；BPZ-6063真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；梅特勒 AL-204分析天平 (梅特勒特利多有限公司)。(+)-兒茶素 (上海友思生物技術(shù)有限公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

圖1 原花青素二聚體類型與結(jié)構(gòu)Fig.1 Type and structure of dimer proanthocyanidin

1.2方法

1.2.1提取方法。將1.5 g茶粉置于250 mL三角瓶中，加入30 mL 70%乙醇溶液，在不同溫度、時間及目數(shù)下水浴提取，冷卻，抽濾，用水定容至50 mL容量瓶中，待用。

1.2.2兒茶素測定方法[4]。采用國際標(biāo)準(zhǔn)法(ISO 14502—2005E)，并以咖啡堿作為內(nèi)標(biāo)法對各兒茶素進(jìn)行定量分析。將“紫娟”原花青素粗提干物質(zhì)濃度配制成2 mg/mL，稀釋一定倍數(shù)后用于兒茶素總量及原花青素聚合度分析。

1.2.3花青素含量測定方法。取一定量花色苷提取液，加入3倍體積的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.0)，混合后于535 nm測量吸光度，并以冰醋酸溶液[50%冰醋酸∶檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.0)=1∶3,V/V]為空白對照?；ㄉ蘸恳陨戎?Color Value,CV)表示，CV=0.1×吸光度×稀釋倍數(shù)。

1.2.4原花青素總量及聚合度的測定方法[5-6]?？偭坎捎? mL樣品或兒茶素的甲醇溶液，2.5 mL 2%香草醛甲醇溶液與2.5 mL 1.8 mol/L硫酸-甲醇溶液混勻(體系含水量控制在8%以下)后于30 ℃水浴反應(yīng)20 min，在500 nm處測定吸光度。

聚合度分析采用含4%濃鹽酸及0.5%香草醛的冰醋酸與含樣品或不同濃度(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的冰醋酸以5∶1的體積比混勻后于510 nm處比色測定。

1.2.5蛋白質(zhì)含量測定方法[7]。采用Bradford方法，取樣50 L，加Bradford工作液5 mL，靜置2 min，在595 nm處測定吸光度，并加做空白試驗作為對照。

1.2.6氨基酸測定方法[8]。取1 mL試液，注入25 mL容量瓶中，加入0.5 mL 0.067 mol/L磷酸氫二鈉溶液和0.5 mL 2%茚三酮水溶液(含0.08%氯化亞錫)，于沸水浴中加熱15 min，放置10～15 min，于570 nm處測定吸光度。

1.2.7數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)，均數(shù)差異顯著性采用t-test一尾分析。

2 結(jié)果與分析

2.1溫度、時間及樣品目數(shù)對有效成分浸提的影響為了有效提取“紫娟”茶中的原花青素等成分，首先考察了溫度對其提取過程的影響，以提取液中相應(yīng)成分的濃度作為參考指標(biāo)。

由圖2可知，隨著溫度的升高，原花青素、花青素、蛋白質(zhì)及氨基酸等成分的浸出率逐漸變大，其中原花青素在70 ℃時達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01,t-test; vs.40 ℃)，70 ℃以上變化不明顯，同時隨著溫度的升高，提取過程中乙醇的揮發(fā)損耗亦隨之增大。雖然花青素、蛋白質(zhì)及氨基酸相比于40 ℃，在55 ℃即達(dá)差異顯著水平，但溶液中原花青素的含量變化遠(yuǎn)高于花青素及蛋白質(zhì)等成分，表明提高溫度可提高原花青素的提取率。

注：*P<0.05;**P<0.01圖2 溫度對原花青素、花青素、蛋白質(zhì)和氨基酸浸提的影響Fig.2 The effect of temperature in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

在溫度調(diào)整至70 ℃的前提下，發(fā)現(xiàn)隨著提取時間的延長(20～60 min)，原花青素在溶劑中的濃度亦增大，60 min以后各成分均未有顯著性差異(圖3)，其中40 min之前原花青素的提取率還未體現(xiàn)出顯著性差異，直至60 min才達(dá)顯著性水平，而氨基酸則在高溫的環(huán)境下更有利于浸提。

注：*P<0.05;**P<0.01圖3 時間對原花青素、花青素、蛋白質(zhì)和氨基酸浸提的影響Fig.3 The effect of time in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

為進(jìn)一步考察茶葉粉碎度對其浸提的影響，以上述結(jié)果為參照，在提取時間60 min以及提取溫度70 ℃的條件下，對原花青素進(jìn)行提取。由圖4可知，目數(shù)能夠顯著提高各成分的浸提率(P<0.01,t-test; 20目 vs.30目)，隨后目數(shù)的增加對其影響不明顯。但過細(xì)的粉碎度反而影響后繼工藝的放大，并且50～60目反而使花青素的溶液濃度降低，其現(xiàn)象有待進(jìn)一步分析。

注：*P<0.05;**P<0.01圖4 目數(shù)對原花青素、花青素、蛋白質(zhì)和氨基酸浸提的影響Fig.4 The effect of mesh number in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

2.2提取物中原花青素聚合度分析原花青素總量及聚合度的分析主要采用兒茶素作為外標(biāo)法定量。由圖5可知，以(+)-兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在濃度為10～320 mg/L、0.017～0.276 μmol/L時均達(dá)到良好水平(R2≥0.990 0)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y=0.001 4x+0.001 0，y=6.692 8x+0.007 2，為后繼測定結(jié)果準(zhǔn)確性提供了保障。

圖5 原花青素總量(a)及聚合度(b)的(+)-兒茶素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 (+)-catechin standard curve for determining proanthocyanidin gross contents (a) and polymerization degree (b)

由表1可知，“紫娟”茶中兒茶素游離單體總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.26%，其總量較大葉種茶提取物偏低[1]，這可能源于大量兒茶素單體一定條件下聚合成原花青素類化合物。鑒于原花青素分解成兒茶素的摩爾數(shù)及原花青素的平均摩爾數(shù)，其所對應(yīng)的平均聚合度為3.09，說明“紫娟”茶中的原花青素主要以低聚體存在。另外，由于茶中的兒茶素不僅有簡單兒茶素，還含有酯型兒茶素，其分子量為290～458 Da，故“紫娟”茶提取物中原花青素的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.71%～78.51%，平均為64.11%。

表1 “紫娟”茶提取物中兒茶素及原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與摩爾數(shù)

注：表中數(shù)據(jù)基于20 mg樣品所得。EGCG為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，EC為表兒茶素，ECG為表兒茶素素沒食子酸酯；(A)為利用香草醛分光光度法所測得的總兒茶素單體摩爾數(shù)；(B)為(A)除去液相色譜所得各兒茶素組分總摩爾數(shù)；原花青素平均摩爾數(shù)為冰醋酸所測得的原花青素總摩爾數(shù)減去表兒茶素后所得值。

Note：The data acquired in this table based on 20 mg ‘Zijuan’tea extraction.EGCG,EC and ECG represent epigallocatechin gallate,epicatechin,and epicatechin gallate,respectively; (A) represents the value of total moles of catechins acquired by mentioned colorimetric method of vanillin; (B) means the value of total moles of catechins obtained from (A) minus the catechins moles of HPLC method acquired; ‘Average molar of proanthocyanidin’represents the total moles of proanthocyanidin measured by mentioned colorimetric method of glacial acetic acid minus the catechins moles measured by HPLC method

3 討論與結(jié)論

“紫娟”茶中不僅含有豐富的花青素，還含有較多的原花青素，故具有良好的保健功效。試驗考察了溫度、提取時間及茶樣粉碎度對原花青素提取效果的影響，結(jié)果表明，隨著各指標(biāo)水平的提升，原花青素含量都有不同程度的增加，其中溫度相對于其他指標(biāo)對原花青素的提取率影響更大。利用(+)-兒茶素外標(biāo)法所測得的“紫娟”茶提取物中的原花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為64.11%，其平均聚合度為3.09，兒茶素的原花青素應(yīng)以低聚合度的形式存在于“紫娟”茶中。

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