張樹花,劉逸塵，胡錦麗，任星潮，晉 偉，張亦陳

(天津市動植物抗性重點實驗室/天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387)

血液是動物體中不可或缺的液體組織，不僅可以運輸生命活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，還對維持動物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有重要作用，機體的免疫反應(yīng)也有血液的參與。血細胞是動物體免疫系統(tǒng)的重要成分，其種類和豐度可以反映機體自身的生理狀態(tài)變化以及外界環(huán)境因子的刺激等[1]。魚類雖然是較低等的水生動物，但與人類一樣，其血液和其中各類血細胞承擔(dān)著運輸、防御、免疫、體液調(diào)節(jié)等功能[1-7]，尤其是其中的白細胞，不僅直接參與大量的免疫應(yīng)答過程，還能敏感地反映自身生理狀態(tài)的變化和對外界刺激的響應(yīng)[8-9]。機體的生理及病理變化往往都能在血細胞的組成和數(shù)量等方面有明確的反應(yīng)，因此，可以通過血液學(xué)指標的檢查了解養(yǎng)殖魚類的健康水平，還能通過 “哨兵魚”的健康狀況評價其生活水域的環(huán)境質(zhì)量[8,10]。很多研究關(guān)注魚類等水生動物的血細胞分類和功能分析，積累了大量相關(guān)研究結(jié)果。李超等[9]采用Ficoll-Urografin法將羅非魚外周血細胞分為紅細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞；唐銀[2]根據(jù)光鏡和電鏡觀察將花斑裸鯉的外周血細胞分為紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和血栓細胞；周玉等[11]利用光鏡和透射電鏡技術(shù)，將鰻鱺外周血細胞分為紅細胞、單核細胞、淋巴細胞、粒細胞和血栓細胞；任培麗等[12]根據(jù)血涂片觀察結(jié)果，將鯽魚血細胞分為紅細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、血栓細胞、淋巴細胞。魚類血細胞的分類模式總體而言基本相近，但對血栓細胞尚未形成較為一致的看法，Shigdar等[13]把魚類的血栓細胞列為白細胞系以外的另一類細胞；但Gao等[14]以及楊淞等[15]則把血栓細胞歸為白細胞。

研究者一直都在嘗試各種準確、快速的血細胞檢測方法。光鏡、電鏡觀察分類計數(shù)等常規(guī)方法耗時長、工作量大，對低豐度細胞類群統(tǒng)計較困難；另一方面，由于魚類血細胞中占比最大的紅細胞有細胞核，用常規(guī)方法難以去除，所以會干擾白細胞的分析，無形中增加了很多不必要的工作量。自動化的血液分析技術(shù)能極大地提高檢測效率，相較于人工，儀器檢測的批次穩(wěn)定性更高，重復(fù)性更好，通量更大。目前，醫(yī)學(xué)血液學(xué)檢測多采用基于流式細胞技術(shù)的自動化分類分析，數(shù)分鐘即可獲得豐富的數(shù)據(jù)，為疾病的診療提供了重要的技術(shù)保障。常規(guī)流式細胞儀在邊界細胞劃分方面缺乏針對魚類有核紅細胞干擾的高效輔助手段，因此一直以來，利用流式細胞儀對魚類進行血液學(xué)檢測的應(yīng)用尚不普遍。Inoue等[16]嘗試用水處理鯉魚血細胞20 s以去除紅細胞，然后將樣品用于流式細胞儀進行分群分析，并把血細胞分為5個類群：紅細胞群、凝血細胞與淋巴細胞混合群、單核細胞群、嗜中性粒細胞群和嗜堿粒細胞群，但未見該方法廣泛應(yīng)用的后續(xù)報道。FlowSight等帶有同步圖像采集功能的流式細胞儀是近年來出現(xiàn)的一類新型多功能快速檢測設(shè)備，除了具備常規(guī)流式類儀器高通量的檢測能力外，還有一個最大特點是能將每一個樣點的明場及其他熒光視場的圖像實時呈現(xiàn)并記錄下來，所以也被稱為圖像輔助流式細胞儀或顯微流式細胞儀、多維全景分析儀。該類儀器在類群邊界劃分方面較常規(guī)流式細胞儀具有顯著的優(yōu)勢，另外由于其改進了檢測模塊以及管路設(shè)計，所以能夠獲得更多方面的測量數(shù)據(jù)，便于精確分群，而且對樣品的適應(yīng)性大大提高，不易堵塞。已經(jīng)有越來越多的研究者利用此類儀器開展各項研究。Pan等[17]利用其分析了細菌的生存能力。也有學(xué)者借助多維全景的圖像輔助開展自噬的研究以及相關(guān)藥物的研發(fā)[18]。

鯽魚是我國廣泛養(yǎng)殖的鯉科經(jīng)濟魚種，其血液學(xué)研究的技術(shù)探索和相關(guān)結(jié)果可為多種養(yǎng)殖魚類提供參考。筆者借助圖像輔助流式細胞儀將白細胞與有核紅細胞區(qū)分開，建立了一種自動化的分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。試驗所用鯽魚購自本地水產(chǎn)市場，體長為(26.7±2.5)cm，體重為(420±30) g?；铙w運回實驗室后暫養(yǎng)5 d，選取體表完好、攝食及運動行為正常的個體用于試驗。

1.1.2試劑。肝素鈉抗凝劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，多聚甲醛購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器。臺式冷凍離心機(Eppendorf公司)； FlowSight圖像輔助流式細胞儀為Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1血細胞樣品的制備。參照楊興棋[19]的采血方法，用經(jīng)肝素鈉處理的注射器從鯽魚尾靜脈微創(chuàng)采集全血，從中吸取20 μL血細胞樣品經(jīng)4%多聚甲醛固定后洗滌3次，用70 μm細胞篩過濾，去除黏連的多細胞團，按照儀器操作說明上機檢測。

1.2.2血細胞分群方法分析。隨機采集10尾鯽魚全血樣本，各收集10萬個樣點，利用本機軟件進行分析，借助同步采集的圖像驗證分群結(jié)果。該研究對比了2種分析方案：一種是常規(guī)流式細胞儀分析所用的根據(jù)前向散射與側(cè)向散射2個方面差異進行分類；另一種是利用本機獨有的明場圖像的面積與長寬比差異對細胞加以區(qū)分。2種方法都根據(jù)各類細胞樣點的聚集情況將其歸入不同類群，并參考儀器同步采集的每個樣點的圖像信息對所劃分類群的準確性進行驗證，確保優(yōu)化的設(shè)門范圍，然后進一步計算細胞比例。

1.2.3急性Cu2+刺激對鯽魚白細胞的影響分析。在初步建立鯽魚血細胞快速分類分析方法的基礎(chǔ)上，參考楊麗華等[20]的研究結(jié)果，設(shè)置鯽魚急性Cu2+刺激試驗，對照組Cu2+添加量為0 mg/L，試驗組為120 mg/L，每組5尾鯽魚。處理24 h后分別抽取對照組和試驗組鯽魚血樣，利用該方法進行血細胞分類計數(shù)和體積變化分析，以了解Cu2+對鯽魚白細胞的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1血細胞分群分析首先參考常規(guī)流式細胞分析的模板，利用反映細胞大小和顆粒度的前向散射和側(cè)向散射參數(shù)對細胞樣點加以區(qū)分，但未能獲得較為理想的分群結(jié)果，絕大部分細胞樣點都集中在一起。輔助圖像驗證顯示其中以有核紅細胞為主，并含有少量白細胞，大部分白細胞樣點分布于前述細胞群的邊緣，偏向面積較大的一側(cè)，但其與紅細胞類群之間界限不夠清晰，所以不利于準確統(tǒng)計各類細胞數(shù)量。

利用圖像輔助流式細胞儀獨有的明場圖像的測量結(jié)果進行分群分析則顯示了較清晰的類群邊界。以面積和長寬比為坐標系做樣點分布散點圖，處于面積較小區(qū)間的一群樣點為紅細胞，其顯著的特點是細胞小，呈橢圓形或長圓形，略有收縮。位于散點圖右側(cè)的是白細胞類群，該類群細胞特征為體積大，形態(tài)近圓形或不規(guī)則；從明場圖像可以看出胞內(nèi)不均一，普遍具有高對比度像素點，提示該類群細胞具有較為復(fù)雜的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。兩群細胞間具有明顯的低密度間隙，可以據(jù)此將其選定為設(shè)門依據(jù)(圖1)。

注： A.鯽魚血細胞流式散點圖，其中R1類群為紅細胞，R2類群為白細胞；B.R1類群的單細胞明場圖像； C.R2類群的單細胞明場圖像；B、C圖中的數(shù)字代表該細胞樣點通過檢測器的序號Note：A.Scatterplot of Carassius auratus blood cells， among them group R1 stands for erythrocytes， and group R2 stands for leukocytes；B.Single-cell images of group R1；C.Single-cell images of group R2；The numbers in B and C represent the sequence number of cells passing through the flow cytometry圖1 鯽魚血細胞的圖像輔助流式分析Fig.1 Blood cells analysis of Carassius auratus by image-based flow cytometry

2.2急性Cu2+刺激對鯽魚白細胞的影響高濃度Cu2+刺激24 h之后，鯽魚體內(nèi)白細胞與對照組相比在數(shù)量和細胞形態(tài)2個方面都發(fā)生了明顯的變化。首先，白細胞計數(shù)急劇下降，從2.3×107個/cm3下降為1.5×107個/cm3，降幅達34.8%；其次，白細胞體積也顯著增大，通過測量白細胞大小的直方圖可以發(fā)現(xiàn)，試驗組僅有79.0%的細胞落在了對照組95.0%的細胞覆蓋的大小區(qū)間，而試驗組更有約16.6%的白細胞大小完全超出了對照組的分布區(qū)間，向體積增大的方向偏移(圖2)。

注：A.對照組白細胞大小分布情況；B.試驗組白細胞大小分布情況Note:A.The size distribution of leukocyte in the control group；B.The size distribution of leukocyte in the experimental group圖2 Cu2+ 刺激對鯽魚白細胞的影響Fig.2 The effect of Cu2+ stimulation on the leucocytes of Carassius auratus

3 結(jié)論與討論

魚類雖然是較為低等的脊椎動物，但具有與人類相似的血液和血細胞構(gòu)成，因此將醫(yī)學(xué)血液學(xué)檢測的技術(shù)原理應(yīng)用于魚類血液檢測一直都是研究者所期望的。對血細胞進行人工染色，借助顯微鏡觀察分類計數(shù)可以了解魚類血細胞在生理和病理條件下的變化，但不適合大規(guī)模、高通量操作。流式細胞技術(shù)具有高通量、自動化等優(yōu)勢[21-23]，但多年來的研究表明常規(guī)流式細胞儀在處理魚類等有核紅細胞與白細胞混合樣品方面區(qū)分度尚不理想，所以還沒有普遍適用的自動化分析方法被廣泛使用。圖像輔助流式細胞儀是近年來衍生出的一種新型檢測設(shè)備，其采用流式進樣方式，保證了檢測的高通量，升級了常規(guī)測量模塊，還為每個檢測通道添加了圖像采集功能，極大地提高了樣品分析的便利性、準確性和效率[24]。

該研究利用圖像輔助流式細胞儀對鯽魚血細胞進行了初步的自動化分類分析和應(yīng)用的探索。在區(qū)分有核紅細胞與白細胞類群邊界方面，該儀器表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。與常規(guī)流式細胞儀需要將樣品回收分析后才能確定樣點特征不同，該儀器可以直接通過同步采集的圖像對樣點進行甄別；更為重要的是，可以針對任意一個樣點單獨分析，這對于常規(guī)流式細胞儀而言，相當于連續(xù)單獨回收類群邊界的每一個細胞再加以甄別，實際上在操作中是無法實現(xiàn)的。前向散射和側(cè)向散射特征對于不經(jīng)熒光標記的細胞是較為常用的區(qū)分指標，但在無法去除的大量有核紅細胞的干擾下，很難發(fā)揮其區(qū)分效力。該研究也遇到了這種情況，不但有白細胞混雜在紅細胞類群當中，而且白細胞與紅細胞的類群邊界也不清晰，雖然在紅細胞和白細胞各自樣點聚集范圍之間存在低密度區(qū)，但通過單獨樣點的明場圖像辨識發(fā)現(xiàn)此區(qū)域仍然是混合細胞群。該研究又進一步嘗試利用該儀器獨有的明場圖像信息對血細胞進行分群分析，獲得了較為理想的結(jié)果。以面積和長寬比為坐標系的散點圖可以呈現(xiàn)出較為清晰的2個細胞聚集區(qū)。位于面積較小的區(qū)間內(nèi)的細胞數(shù)量占絕大多數(shù)，且具有紅細胞的典型特征，體積較小，長寬比較大，加之胞內(nèi)缺乏類似白細胞內(nèi)的復(fù)雜膜系統(tǒng)，所以甲醛固定后更容易收縮，其體積與大部分白細胞甚至其中的小淋巴細胞的差距都更為明顯，所以整個類群幾乎不含有明顯可辨的白細胞。另一方面，從白細胞類群的占比也可作出同樣的推斷，該方法設(shè)定的白細胞門內(nèi)所包含的白細胞占比與已報道的同類研究結(jié)果吻合(表1)。更為重要的是，同步采集的每個樣點的明場圖像提供了其形態(tài)學(xué)的佐證。

表1 該研究結(jié)果與已發(fā)表結(jié)果的對比

注：*該數(shù)據(jù)是根據(jù)引用文獻中的分類計數(shù)結(jié)果計算所得

Note：*Results were calculated based on published papers

在初步建立基于圖像輔助流式細胞儀的鯽魚血細胞分類分析方法的基礎(chǔ)上，該研究進一步嘗試將其用于實踐檢驗的可行性。重金屬離子污染是一種常見的環(huán)境脅迫，Cu2+是其中的代表之一，會導(dǎo)致魚類等水生動物出現(xiàn)游泳行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變甚至死亡等一系列的異常癥狀[28]。血細胞變化可以作為其毒性效應(yīng)的重要參考指標[1]。該研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的Cu2+急性脅迫對鯽魚產(chǎn)生的影響可反映在其血細胞計數(shù)、比例變化及形態(tài)改變方面，其中較為直觀的就是細胞計數(shù)下降和細胞體積腫脹。該特征與史增奎[29]、王麗[30]的研究結(jié)果一致，表明Cu2+通過誘發(fā)細胞水腫等表征導(dǎo)致細胞損傷、破裂，但其深層次的機理尚需通過離子通道分析等綜合研究進一步解析。上述結(jié)果提示，基于圖像輔助流式細胞儀的自動化血細胞分類分析方法適用于魚類血細胞分類和計數(shù)等方面的測量需求。

血液中的細胞承擔(dān)了氣體輸送和機體防御等重要功能，其中各類細胞的種類和數(shù)量均必須在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定，從而確保機體處于健康狀態(tài)。當機體遭遇病原刺激或者環(huán)境脅迫時，遍布周身的血細胞往往能在第一時間做出反應(yīng)，無論是主動應(yīng)答還是被動適應(yīng)，因此對血細胞的分析是一種敏感、快速的健康監(jiān)測手段[1-2]。血象分析是醫(yī)學(xué)血液學(xué)研究和檢測的重要方法，其中對各種細胞分類計數(shù)的信息能在極短時間內(nèi)為健康診斷提供指向性的參考，所以各類自動化的技術(shù)和裝備都已在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[31-32]。流式細胞技術(shù)作為一種快速高通量的樣品分析平臺，輔以各種先進檢測模塊可以衍生出各種新型檢測設(shè)備，服務(wù)于不同領(lǐng)域的需求，其自動化、高通量、多維度等優(yōu)勢越來越受到研究者的重視。在當前水產(chǎn)動物疫病頻繁大規(guī)模暴發(fā)的情況下，提前發(fā)現(xiàn)，提前預(yù)警，盡早采取有針對性的預(yù)防措施顯得尤為重要，而這都依賴于快速準確的分析和診斷。該研究針對魚類血細胞高通量自動化分析這個關(guān)鍵點，將圖像輔助流式細胞儀引入魚類血細胞分析，利用其獨有的同步圖像信息進行輔助分群，建立了一種較為優(yōu)化并且具有一定實用性的自動分析方法。該方法采用微創(chuàng)采血，僅需不到10 μL全血的細胞量即可獲得具有重要參考價值的診斷信息；另一方面，該方法操作非常簡便，采血后直接固定30 min即可上樣分析，每個樣品僅需1 min即可采集數(shù)萬細胞樣點，因此對于批量制備的樣品，可實現(xiàn)每小時數(shù)十個樣品的檢測速度。由于每個樣品的檢測通量可以達數(shù)萬細胞，而且高質(zhì)量的測量模塊可以確保每個樣品的測量和判定標準保持高度一致，為能早期發(fā)現(xiàn)血細胞種類和數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)上的細微差異提供了重要的技術(shù)保證，也有望為疾病早期預(yù)警提供參考。

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