阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)退行性疾病,常表現(xiàn)為記憶力減退、認知功能障礙及生活能力降低。目前,AD的發(fā)病機制仍不明確,對于AD的有效藥物治療依然很少。α硫辛酸是一種獨特的氧化-還原雙向的氧化應(yīng)激強效抑制劑,研究表明氧化應(yīng)激是AD發(fā)生發(fā)展的重要原因,而cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)在抑制凋亡、促進細胞的分化再生、調(diào)節(jié)細胞的代謝、損傷后的修復(fù)等方面有重要的意義。本研究旨在檢測α硫辛酸對AD大鼠海馬中CREB、Bcl-2蛋白表達的影響,探討α硫辛酸對于AD可能的保護作用及其機制,為α硫辛酸對于臨床治療AD提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:健康雄性SD大鼠24只,鼠齡8～12周,體質(zhì)量250～300 g,由河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要儀器和試劑:Morris水迷宮(北京新天地公司);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒;紅外線掃描儀(Odyssey Li-cor Gene公司);Aβ1-42(美國sigma公司);p-CREB、Bcl-2(Cell signaling Technology公司);α硫辛酸(美國sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:健康雄性SD大鼠于造模前進行水迷宮訓(xùn)練3 d,剔除不符合實驗要求的大鼠。隨機分為假手術(shù)組、模型組、α硫辛酸組,每組各8只。

1.2.2 造模方法:用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射的方式對大鼠進行麻醉,將大鼠固定于腦立體定位儀上,選擇Aβ1-42注射靶區(qū)為雙側(cè)海馬CA1區(qū),即前囟向后4.5 mm,矢狀縫旁開2 mm。鉆開顱骨,暴露硬腦膜,微量進樣器緩慢將5 μl聚集態(tài)1 μg/μl Aβ1-42注入海馬區(qū),注射時間為10 min,并留針10 min,使Aβ1-42充分浸潤局部組織。注射完畢緩慢撤針,用骨蠟封堵針孔,縫合切口,局部消毒。假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。

1.2.3 給藥方法:α硫辛酸組給予α硫辛酸100 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/d。假手術(shù)組、模型組腹腔注射等體積的生理鹽水,1次/d。共21 d。

1.2.4 Morri水迷宮測試:藥物干預(yù)完成后運用Morris水迷宮實驗方法進行水迷宮測試。(1)定位航行試驗:將大鼠隨機從水池四個入水點放入水中,入水時使大鼠面向池壁,記錄實驗大鼠逃避潛伏期時間,即在120 s內(nèi)尋找到平臺的時間。連續(xù)測試5 d,2次/d。測試大鼠每天的最終結(jié)果為2次4個象限潛伏期的平均值。(2)空間探索試驗:測試第6 d撤除平臺,將大鼠從入水點面向池壁放入水中,記錄其120 s內(nèi)穿越原來平臺位置的次數(shù)。其學(xué)習(xí)記憶能力根據(jù)大鼠潛伏期的長短和穿越原平臺次數(shù)表示。

1.2.5 大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的觀察:大鼠斷頭取出腦組織,置于4%多聚甲醛內(nèi)4 ℃冰箱固定48 h。將腦組織標(biāo)本常規(guī)各梯度乙醇脫水,二甲苯透明,融化的石蠟內(nèi)充分浸蠟包埋,行切片厚度為5 μm的連續(xù)切片。將切片脫蠟至水洗,用蘇木精水溶液染5 min,自來水浸泡15 min,伊紅染色5 min,脫水透明,封片,用光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

1.2.6 Western Blot測定大鼠海馬p-CREB、Bcl-2的表達:大鼠斷頭取腦分離出海馬組織,置液氮中保存。取海馬組織加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑混合物,用超聲勻漿器破碎組織后離心,取上清作為待分析的樣品。用BCA法測定蛋白濃度。取樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜,TBST封閉,分別與p-CREB、Bcl-2、抗GAPDH抗體進行雜交,4 ℃孵育過夜,洗膜3次,加二抗室溫孵育1 h,TBST洗二抗4次。洗膜后應(yīng)用紅外激光成像系統(tǒng)檢測p-CREB、Bcl-2的蛋白表達,以GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試學(xué)習(xí)記憶能力

2.1.1 定位航行實驗結(jié)果:各組大鼠5 d內(nèi)水迷宮中逃避潛伏期隨時間延長均有下降,隨著訓(xùn)練的次數(shù)的增多,假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期明顯下降,而AD模型組大鼠逃避潛伏期下降不明顯,2組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);α硫辛酸組與AD模型組比較,大鼠的逃避潛伏期明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠在水迷宮中逃避潛伏期的比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與AD模型組比較,△△P<0.01

2.1.2 空間探索實驗結(jié)果:AD模型組跨越平臺次數(shù)為(5.88±1.83)次,與假手術(shù)組的(14.75±2.99)次比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);α硫辛酸組跨越平臺次數(shù)為(9.54±3.09)次,與AD模型組比較,α硫辛酸組穿越平臺的次數(shù)明顯增加(P<0.01)。

2.2 大鼠海馬CAl區(qū)HE染色 假手術(shù)組錐體細胞數(shù)量稍有減少,其形態(tài)、排列及分布無明顯差異;AD模型組海馬CAl區(qū)錐體細胞較正常對照組細胞數(shù)量明顯減少,細胞腫脹,核結(jié)構(gòu)模糊,結(jié)構(gòu)輪廓模糊,大小形態(tài)不規(guī)則,排列稀疏;α硫辛酸組與AD模型組大鼠相比,大鼠海馬數(shù)量和形態(tài)均不同程度恢復(fù),錐體細胞數(shù)量增多,無明顯腫脹,結(jié)構(gòu)完整,細胞排列整齊、致密。見圖1。

圖1 各組海馬CAl區(qū)HE染色

2.2 Western Blot測定大鼠海馬p-CREB、Bcl-2的蛋白表達水平 與假手術(shù)組比較,AD模型組中大腦海馬組織中p-CREB、Bcl-2蛋白水平表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與AD模型組相比,α硫辛酸組大鼠海馬p-CREB、Bcl-2蛋白水平表達明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2、圖2、圖3。

表2 各組p-CREB和Bcl-2表達水平比較(n=8)

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與AD模型組比較,△△P<0.01

圖2 各組標(biāo)本p-CREB蛋白表達情況

圖3 各組標(biāo)本Bcl-2蛋白表達情況

3 討論

AD典型的病理學(xué)特征是老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元減少。而老年斑的核心為Aβ,Aβ在腦內(nèi)沉積是AD早期的主要病理變化,凝聚狀態(tài)的Aβ和Tau蛋白共同作用于細胞及細胞器,二者相互作用放大對神經(jīng)元的毒性作用[1]。本研究向大鼠的海馬雙側(cè)注射Aβ1-42,使大鼠的神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死,促進凋亡基因的表達,從而形成學(xué)習(xí)與記憶能力減退的AD動物模型。Morris水迷宮結(jié)果顯示,AD模型組大鼠的平均逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著延長,跨越平臺的次數(shù)也明顯減少,而給予α硫辛酸干預(yù)后,α硫辛酸組在空間辨別、學(xué)習(xí)記憶方面明顯改善。從病理形態(tài)學(xué)上表現(xiàn),HE染色可見AD模型組海馬CAl區(qū)神經(jīng)元細胞減少,核結(jié)構(gòu)模糊,錐體細胞層排列紊亂,而α硫辛酸干預(yù)組神經(jīng)元的損害較AD模型組減輕。

p-CREB稱為“轉(zhuǎn)錄增強因子”,主要表現(xiàn)為能夠刺激基因轉(zhuǎn)錄,是多種蛋白激酶的磷酸化底物。研究發(fā)現(xiàn),長時性記憶需要新蛋白質(zhì)的合成[2],活化了的p-CREB是學(xué)習(xí)記憶的分子標(biāo)志,可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性,促進學(xué)習(xí)記憶基因被大量轉(zhuǎn)錄,并進一步促進與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的新蛋白質(zhì)的合成,促進長時性記憶的形成[3]。Bcl-2是被認為具有抗凋亡作用的重要基因之一,而細胞凋亡是AD引起神經(jīng)元喪失的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在AD病人腦退化的神經(jīng)細胞中,Bcl-2基因的含量明顯減少[4]。同時有研究證實,Aβ1-42可以下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達[5]。本實驗研究的結(jié)果顯示,雙側(cè)海馬一次性注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型后,模型組大鼠海馬p-CREB及Bcl-2的蛋白表達水平較假手術(shù)組明顯降低,說明了模型組大鼠海馬CREB-Bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活動受抑制,從而損害了AD模型大鼠的記憶學(xué)習(xí)能力。

氧自由基能夠氧化修飾多種生物活性分子,使細胞原有的功能和結(jié)構(gòu)完全喪失,生物酶失活,最終引起細胞凋亡[6]。研究顯示Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞生產(chǎn)氧自由基,在對抗氧化應(yīng)激過程中,腦組織會代償性地加速Aβ生成,同時氧化應(yīng)激還可誘導(dǎo)Tau蛋白的磷酸化[7],二者共同作用,加大神經(jīng)毒性作用。α硫辛酸是目前已知效果最強的一種天然抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn),α硫辛酸能夠在體外抑制Aβ蛋白聚集,減少Aβ的形成,同時還能夠使已經(jīng)聚集的Aβ降解[8]。Farr等[9]的研究表明,給予α硫辛酸干預(yù)的轉(zhuǎn)基因AD模型大鼠較未干預(yù)的大鼠在學(xué)習(xí)和記憶能力方面明顯增強。

綜上所述,α硫辛酸能夠保護Aβ對海馬神經(jīng)細胞的損害,提高AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其可能的作用機制是通過抑制氧化應(yīng)激損傷,提高大腦海馬組織中CREB-Bcl-2信號通路的活化水平,從而減少神經(jīng)細胞凋亡,促進學(xué)習(xí)及記憶功能。本研究結(jié)果為α硫辛酸應(yīng)用于AD的治療提供了一定的理論依據(jù),但由于本實驗僅為動物實驗,樣本數(shù)量相對較少,對于α硫辛酸應(yīng)用于臨床還需要更多的研究給予支持。

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