王祖浩，郭勇，周美含，劉春雷，方麗，閔偉紅

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）（2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

氧化還原反應(yīng)是人體內(nèi)進(jìn)行的一種生理化學(xué)反應(yīng)，人體在代謝過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，同時(shí)體內(nèi)的氧化防御系統(tǒng)會(huì)清除活性氧自由基。正常情況下，健康人體抗氧化防御能力健全，防御系統(tǒng)處于動(dòng)平衡狀態(tài)，即人體內(nèi)氧化自由基的產(chǎn)生和被清除處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[1]。然而，一旦人體產(chǎn)生大量活性氧自由基或抗氧化防御體系出現(xiàn)紊亂時(shí)，大量的活性氧自由基不能被及時(shí)清除，這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，造成機(jī)體氧化損傷，導(dǎo)致衰老，甚至發(fā)生臟器病變、細(xì)胞死亡、組織受損、糖尿病和冠狀動(dòng)脈硬化等許多慢性疾病[2,3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用動(dòng)物或植物蛋白通過(guò)酶控制水解技術(shù)制備獲得了較好抗氧化作用的多肽，例如：玉米蛋白肽[4]、花生仁蛋白肽[5]和牛乳酪蛋白[6]等[7]。榛子富含脂肪 59.1%～69.8%、蛋白質(zhì)14.1%～18.0%、碳水化合物 6.5%～9.3%、膳食纖維8.2%～9.6%及多種礦物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含包括人體8種必需氨基酸在內(nèi)的20余種氨基酸，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，亦是制備功能肽的食源性蛋白[8,9]。目前，抗氧化肽已成為活性肽研究中的熱點(diǎn)，研究人員已從動(dòng)植物蛋白中篩選出了一些具有較強(qiáng)抗氧化活性的天然抗氧化肽。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中通過(guò)酶法定向水解制備多肽、Sephadex G-25、Sephadex G-15、反相高效液相色譜分離純化、質(zhì)譜鑒定和化學(xué)合成獲得長(zhǎng)白山榛仁蛋白五肽Ala-Trp-Asp-Pro-Glu，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)化學(xué)和細(xì)胞模型等方法，研究其對(duì)自由基的清除作用及對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為長(zhǎng)白山地區(qū)榛子蛋白資源的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，促進(jìn)優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源的高效利用。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

Ala-Trp-Asp-Pro-Glu肽：北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度96.87%。

1.2 試劑及來(lái)源

DPPH、抗壞血酸（Vc）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、二甲基亞砜(DMSO)、四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI·1640培養(yǎng)液、雙抗、EDTA胰酶、胎牛血清、PBS溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；HUVEC細(xì)胞、上海中喬新舟生物科技有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（Z36HK），HERMLE公司（德國(guó)）；酶標(biāo)儀（SPECTRA MAX 190），美國(guó)（Molecular Devices）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1700），日本島津；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（CB150），德國(guó)BINDER公司；熒光倒置顯微鏡（IX53），日本Olympus公司；超凈工作臺(tái)（AIRTECH），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；等常用儀器設(shè)備。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 榛仁活性肽制備

以長(zhǎng)白山脫脂榛仁粉為原料，采用堿溶酸沉法制備分離蛋白，利用堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽，經(jīng)過(guò)Sephadex G-25、Sephadex G-15、RP-HPLC三步純化后，通過(guò)質(zhì)譜鑒定出分子量為 616.63 u的Ala-Trp-Asp-Pro-Glu榛仁肽，最后由北京中科亞光生物科技有限公司合成純度為96.87%五肽。

1.4.2 AWDPE對(duì)體外自由基清除能力的測(cè)定

1.4.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照謝正軍的試驗(yàn)方法[10]。

DPPH 清除率=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100

1.4.2.2 ABTS+·自由基清除能力的測(cè)定

參照Kong B的試驗(yàn)方法[11]。

ABTS 清除率=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100

1.4.3 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)

取得原代HUVEC細(xì)胞，將其培養(yǎng)瓶放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，待其生長(zhǎng)穩(wěn)定后，進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)液：10%培養(yǎng)液：90 mL 1640培養(yǎng)液+10 mL胎牛血清+2 mL雙抗），細(xì)胞傳代，細(xì)胞凍存（細(xì)胞凍存液：1640培養(yǎng)液：胎牛血清：DMSO=6：3：1）處理。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好4～9代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 MTT法檢測(cè)AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用

選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的 HUVEC細(xì)胞用胰酶消化，用10%培養(yǎng)液制成密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，三個(gè)平行樣，空白對(duì)照組和劑量組（樣品終濃度分別為0、1、10、50、100、500、1000 μg/mL），于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h后，加入MTT溶液（終濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，震蕩10 min至甲臜結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)A570nm值。

細(xì)胞存活率%=(A樣品組/A空白對(duì)照組)×100%。

1.4.5 HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型的建立

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、AngⅡ組（計(jì)量終濃度梯度為 0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L），于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)不同時(shí)間（0、2、4、6、8 h）[12]，其他操作同1.4.4。

1.4.6 AWDPE對(duì)AngⅡ氧化損傷HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、AngⅡ損傷組和樣品保護(hù)組，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HUVEC細(xì)胞用胰酶消化，用10%培養(yǎng)液制成密度為 1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以 1 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后（約接種24 h），饑餓培養(yǎng)4 h后，樣品保護(hù)組加入AWDPE溶液（樣品終濃度分別為1、10、50、100、500、1000 μg/mL），培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，AngⅡ損傷組和樣品保護(hù)組分別加入終濃度為10-7mol/L AngⅡ，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)6 h，其他操作同1.4.4。

1.4.7 分析AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞內(nèi)各種抗氧化酶的影響

按照南京建成生物工程研究所，MDA、LDH、CAT、T-SOD、GSH-PX、總蛋白定量試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 AWDPE對(duì)DPPH、ABTS+·自由基清除能力的分析

Hernández等[23]人研究發(fā)酵乳中抗氧化肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)His、Pro（疏水性氨基酸）可顯著提高抗氧化肽的抗氧化活性，Trp（疏水性氨基酸）、Tyr對(duì)ABTS+自由基清除的貢獻(xiàn)最大，因?yàn)檫@類氨基酸的吲哚基和苯環(huán)可供氫。本研究中AWDPE清除ABTS+自由基活性能力較強(qiáng)，可能是與其含有的Trp和Pro有關(guān)。另外，Ali Bougatef等[24]人利用沙丁魚副產(chǎn)物水解分離出的抗氧化肽，研究其抗氧化功能，利用DPPH自由基清除能力檢驗(yàn)其抗氧化能力。本研究中AWDPE所含有的氨基酸與其所研究的活性肽含有的氨基酸成分部分一致。

2.2 AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用

圖2為利用MTT試驗(yàn)法，考察AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用。由圖可知，以空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%，除50 μg/mL濃度外，不同濃度AWDPE對(duì)細(xì)胞存活率的影響與空白組相比并無(wú)差異顯著性，說(shuō)明AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)毒性作用，對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖亦無(wú)促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是安全的。50 μg/mL濃度雖然細(xì)胞存活率升高，具有差異顯著性，但細(xì)胞存活率升高并不大，與不同濃度 AWDPE其他組分的細(xì)胞存活率相比并無(wú)差異顯著性。

圖1 AWDPE對(duì)DPPH、ABTS自由基清除作用Fig.1 The scavenging effect of AWDPE on DPPH and ABTS radicals

圖2 不同濃度AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of AWDPE on the survival rate of HUVEC cells

2.3 HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型的建立

圖3考察不同濃度AngⅡ溶液，作用不同時(shí)間對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響。由圖可知，不同濃度AngⅡ溶液，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)AngⅡ溶液濃度為10-3和10-4mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至空白組的0.202倍，說(shuō)明該濃度對(duì)細(xì)胞刺激過(guò)于嚴(yán)重而導(dǎo)致細(xì)胞存活率低。當(dāng)AngⅡ濃度為10-5、10-6、10-8和10-9mol/L，細(xì)胞存活率相差不大。而當(dāng)AngⅡ濃度為10-7mol/L時(shí)，培養(yǎng)6 h和8 h時(shí)細(xì)胞存活率均為空白組的0.534倍，細(xì)胞損傷明顯且穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型選擇濃度為10-7mol/L AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷6 h。

圖3 不同濃度AngⅡ?qū)UVEC細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of AngⅡon the survival rate of HUVEC cells

2.4 AWDPE對(duì)AngⅡ氧化損傷HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用

圖4 不同濃度AWDPE和10-7 mol/L AngⅡ?qū)UVEC細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of AWDPE and 10-7 mol/L of AngⅡon the survival rate of HUVEC cells

如圖4所示，AngⅡ損傷組細(xì)胞存活率為空白對(duì)照組的 0.45倍，表現(xiàn)出差異極顯著性（p＜0.01），說(shuō)明終濃度為10-7mol/L的AngⅡ溶液處理細(xì)胞6 h后，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了損傷作用。不同濃度AWDPE保護(hù)組與AngⅡ損傷組相比，細(xì)胞存活率均極顯著高于損傷組（p＜0.01），說(shuō)明AWDPE對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了抗氧化保護(hù)作用。結(jié)合2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)論，證明了AWDPE對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用源于其自身的抗氧化性，與其他因素?zé)o關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選取50 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL 這3 個(gè)濃度的AWDPE溶液開(kāi)展后續(xù)研究。

2.5 HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的變化

圖5 HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的變化Fig.5 The changes in the growth morphology of HUVEC cells

由圖5中可以看出，a表明正常生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的菱形、多邊形和梭形鑲嵌排列，生長(zhǎng)旺盛，大小均勻，邊緣清晰。b表明加入 AWDPE的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)與a并無(wú)明顯差別，可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)自身形態(tài)，展現(xiàn)細(xì)胞分裂過(guò)程。c表明經(jīng)AngⅡ刺激6 h后的細(xì)胞，生長(zhǎng)數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞胞體呈現(xiàn)圓形，出現(xiàn)聚縮現(xiàn)象，脫離培養(yǎng)瓶，懸浮于培養(yǎng)液中，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。d表明經(jīng)AWDPE處理后的細(xì)胞，在經(jīng)AngⅡ刺激6 h后，改變形態(tài)的細(xì)胞明顯減少，大部分還呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明 AWDPE對(duì)AngⅡ氧化損傷的HUVEC細(xì)胞具有的保護(hù)作用。

2.6 AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞抗氧化酶的影響

詳見(jiàn)圖6a-e。乳酸脫氫酶（LDH）是一種穩(wěn)定的存在于所有細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶。一般情況下，LDH穩(wěn)定的存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，但細(xì)胞受到刺激，胞膜受損后，LDH隨著受損情況而釋放出不同的量，進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi) LDH含量，計(jì)算出LDH釋放率而推斷細(xì)胞的受損程度[16]。如圖6a所示，陰性對(duì)照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液對(duì)HUVEC細(xì)胞的氧化損傷非常明顯，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，LDH釋放率最高，達(dá)到42.26±2.23%，為空白組9.06倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護(hù)組處理后，100 μg/mL AWDPE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)LDH釋放率降低為27.14±1.16%，為陰性對(duì)照組0.62倍（p＜0.01），接近于陽(yáng)性對(duì)照Vc組。這說(shuō)明AWDPE處理后的細(xì)胞，細(xì)胞膜受損程度降低，大幅度提高細(xì)胞的生命力，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，證明了AWDPE對(duì)于HUVEC細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

丙二醛（MDA）為過(guò)氧化脂質(zhì)中的產(chǎn)物，氧化過(guò)程中產(chǎn)生的MDA會(huì)攻擊細(xì)胞膜，而引起細(xì)胞損傷[17]。如圖6b所示，陰性對(duì)照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)MDA含量達(dá)到（4.15±0.22）nmol/mg，為空白組1.49 倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護(hù)組處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量有所下降，500 μg/mL AWDPE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)MDA含量為（3.47±0.28）nmol/mg，為陰性對(duì)照組0.73倍，但無(wú)差異顯著性。這可能與細(xì)胞內(nèi)本身含有一定量的MDA有關(guān)，經(jīng)AWDPE保護(hù)后的細(xì)胞，產(chǎn)生的MDA含量有所降低，間接的說(shuō)明了其在一定程度上阻止了細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。

過(guò)氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，其處于所有已知?jiǎng)游锏母鱾€(gè)組織中[18]。如圖 6c所示，陰性對(duì)照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細(xì)胞中，CAT含量最低為（1.94±0.18）U/mg，為空白組0.54倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護(hù)組處理后，100 μg/mL AWDPE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi) CAT含量為（2.34±0.11）U/mg，為陰性對(duì)照組1.39 倍(p＜0.05），證明了AWDPE具有一定的抗氧化性，降低了細(xì)胞內(nèi)CAT的消耗量，從而保護(hù)細(xì)胞的完整性，AWDPE對(duì)于HUVEC細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

總超氧化物歧化酶（T-SOD）是一種新型酶制劑，生物界分布廣泛，是一種重要的抗氧化劑，保護(hù)暴露于空氣中細(xì)胞免受氧化損傷[19,20]。如圖6d所示，陰性對(duì)照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細(xì)胞中，T-SOD 含量最低為(12.28±2.27)U/mg，為空白組0.28倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護(hù)組處理后細(xì)胞體內(nèi)，T-SOD含量隨著AWDPE濃度升高而隨之增加，呈濃度依賴性關(guān)系，100 μg/mL和500 μg/mL AWDPE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)T-SOD含量為（19.88±1.99）U/mg和（23.55±1.26）U/mg，為陰性對(duì)照組的 2.18倍（p＜0.01）和2.48倍（p＜0.01），說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)T-SOD消耗量少，進(jìn)而證明AWDPE對(duì)于HUVEC細(xì)胞體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，保證細(xì)胞完整性。

圖6 不同濃度AWDPE、1 mg/mL Vc和10-7 mol/L AngⅡ?qū)UVEC細(xì)胞抗氧化酶的影響Fig.6 Effects of different concentrations of AWDPE, 1 mg/mL of Vc and 10-7 mol/L of Ang II on the antioxidant enzymes of HUVEC cells

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。它的生理功能主要是催化 GSH參與過(guò)氧化反應(yīng)，清除在細(xì)胞呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物和羥自由基，從而減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用[21,22]。如圖6e所示，陰性對(duì)照組，終濃度為10-7mol/L AngⅡ溶液氧化損傷刺激后的細(xì)胞中，GSH-PX 含量最低為(22.2±2.99)nmol/L，為空白組 0.4 倍（p＜0.01）；經(jīng)AWDPE保護(hù)組處理后的細(xì)胞體內(nèi)，GSH-PX含量隨著AWDPE濃度的升高而隨之增加，呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，500 μg/mL AWDPE保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)GSH-PX含量為（33.9±2.75）nmol/L（p＜0.01），為陰性對(duì)照組的1.91倍。經(jīng)AWDPE保護(hù)的細(xì)胞中，GSH-PX含量減少，進(jìn)一步證明了AWDPE對(duì)于HUVEC細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，保證細(xì)胞的完整性。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的研究結(jié)果與曹小舟等[25]研究的小麥胚芽抗氧化肽和林松毅等[26]研究的松子抗氧化肽，在細(xì)胞水平上結(jié)果趨勢(shì)一致。證明了AWDPE肽可通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，進(jìn)而證明了AWDPE的抗氧化能力。

3 結(jié)論

3.1 AWDPE抗氧化肽對(duì)DPPH、ABTS+自由基清除能力呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系，證明其具有良好的抗氧化能力；除50 μg/mL外，不同濃度的AWDPE抗氧化肽對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制亦無(wú)促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)無(wú)影響，進(jìn)而證明AWDPE對(duì)于細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用源于其自身的抗氧化能力；AWDPE抗氧化肽保護(hù)組的細(xì)胞存活率極顯著高于AngⅡ氧化損傷組的細(xì)胞存活率，說(shuō)明AWDPE抗氧化肽具有保護(hù)HUVEC細(xì)胞免受氧化損傷的能力和良好的抗氧化性，但其在50 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL細(xì)胞存活率變化不明顯，這與其在不同濃度下所作用的抗氧化酶活性有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

3.2 建立AngⅡ氧化刺激損傷HUVEC細(xì)胞模型，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系，研究AWDPE對(duì)HUVEC細(xì)胞的保護(hù)和抗氧化能力，經(jīng) AWDPE處理后的HUVEC細(xì)胞內(nèi)LDH釋放率和MDA水平下降，CAT、T-SOD和GSH-PX水平升高，表明AWDPE可通過(guò)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶系統(tǒng)降低細(xì)胞損傷，增強(qiáng)HUVEC應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的能力。

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