周志航，從彥麗，唐旭蔚，彭夢(mèng)雪,2

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055）（2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541004）

蘋果是世界上膳食消費(fèi)量較大的水果之一，其食用方式主要是鮮食，此外還可制成果汁、果酒、果醋和果醬等。流行病學(xué)研究表明，飲食結(jié)構(gòu)中富含蘋果與肺癌[1]、結(jié)腸癌[2]、腎癌[3]等癌癥的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，蘋果及其制品能有效改善衰老、糖尿病、心肺功能、胃腸道功能[4]。多酚是蘋果的主要生物活性物質(zhì)之一，蘋果多酚主要含羥基肉桂酸、二氫查爾酮、黃酮醇和低聚原花青素等[5]。蘋果由于富含多酚類生物活性物質(zhì)，飲食中消費(fèi)蘋果具有潛在的預(yù)防癌癥發(fā)生的作用。

傳統(tǒng)評(píng)價(jià)多酚生物活性的數(shù)據(jù)大都基于化學(xué)提取，即采用丙酮、甲醇、乙酸乙酯和石油醚等有機(jī)溶劑萃取，提取條件與胃腸道的消化環(huán)境相差較遠(yuǎn)，而多酚在胃腸道中的釋放取決于許多因素，如消化酶、pH和食物基質(zhì)等[6]。多酚在食物中以酯、苷和聚合物的形式存在，可通過(guò)非共價(jià)鍵（如氫鍵、疏水作用力、離子鍵）與蛋白質(zhì)、多糖形成復(fù)合物[7]。在胃酸低pH條件下，黃酮類低聚物降解成更小的結(jié)構(gòu)單元；在小腸中，多酚可能會(huì)發(fā)生去糖基化、葡萄糖醛酸化、甲基化、磺化以及類黃酮的羥基化等化學(xué)變化[8]。多酚物質(zhì)在胃腸道消化過(guò)程中的這些變化有可能對(duì)其生物活性產(chǎn)生較大的影響，如黑莓多酚經(jīng)消化代謝后的產(chǎn)物可以以較低的、接近生理血藥的濃度保護(hù)神經(jīng)母細(xì)胞，避免其被 H2O2誘導(dǎo)死亡，而其有機(jī)溶劑提取物在高于生理提取五倍的濃度下也沒(méi)有保護(hù)作用[9]。評(píng)價(jià)蘋果多酚在機(jī)體中的潛在生物活性，應(yīng)該考慮到其在胃腸道中發(fā)生的物理化學(xué)變化。相對(duì)于有機(jī)溶劑提取法，基于模擬胃腸消化的評(píng)價(jià)結(jié)果更合理。在基于體外模擬胃腸消化法評(píng)價(jià)水果營(yíng)養(yǎng)的工作中發(fā)現(xiàn)，模擬胃腸消化過(guò)程可以影響多酚的釋放量、穩(wěn)定性和生物有效性等[10,11]。

目前評(píng)價(jià)蘋果抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究主要基于有機(jī)溶劑提取法，尚不清楚蘋果模擬胃腸消化后的提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性。本研究分別采用80%丙酮提取以及模擬胃腸消化法提取蘋果中的多酚，通過(guò)高效液相色譜測(cè)定提取物的多酚釋放量，并基于 HepG2細(xì)胞系評(píng)價(jià)蘋果提取物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。研究結(jié)果將豐富水果營(yíng)養(yǎng)健康評(píng)價(jià)理論知識(shí)，有利于開發(fā)利用蘋果多酚類生物活性物質(zhì)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

青蘋果和嘎啦果產(chǎn)地為智利，水晶富士產(chǎn)地為山東。蘋果全果洗凈、擦干水分、去核后，帶皮迅速切成小塊并混勻備用，蘋果實(shí)驗(yàn)材料均避光保存在-80 ℃。HepG2肝癌細(xì)胞株，購(gòu)買于美國(guó) ATCC（American Type Culture Collection）。

1.1.2 主要試劑

胃蛋白酶、胰酶、膽汁提取物、熒光素鈉鹽、熊果苷、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、新綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、維采寧-2、阿魏酸、芥子酸、白藜蘆醇、槲皮素-3-葡萄糖苷、蘆丁、異牧荊黃素、新北美圣草苷、扁蓄苷、槲皮苷、柚皮素、根皮苷、新橙皮甙、桑色素、柚皮甙、根皮素、異鼠李素、Hepes緩沖液、非必需氨基酸(100×)、青鏈霉素混合液(100×)、甲醇、乙腈，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；William’s Medium E培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、Hank’s平衡鹽溶液（HBSS，1×）、0.05%胰酶-EDTA，購(gòu)自美國(guó) Life-Technologies公司；NaCl、NaHCO3、Na2CO3、濃 HCl、NaOH、KH2PO4、K2HPO4均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C012型組織搗碎機(jī)，山東九陽(yáng)公司；IKA T25 digital Ultra-Turrax型高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；Avanti J-30I型冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司；5180 R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。Laborota 4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；Spectra Max M2型連續(xù)光譜密度熒光檢測(cè)儀，美國(guó) Molecular Devices公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器公司；SRY-1230型恒溫水浴搖床，美國(guó) crystal公司。高效液相色譜（LC-20 A），日本島津公司；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Milli-Q 超純水器，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。HERA cell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó) Thermo公司；DMIRB型熒光倒置顯微鏡，德國(guó)Leica儀器公司。

1.3 80%丙酮提取蘋果游離酚

參照熊云霞[12]的方法并稍作改進(jìn)。蘋果去籽后取全果（含果肉和果皮），100 g蘋果碎片與200 g 80%丙酮（4 ℃）混合，經(jīng)組織攪碎機(jī)搗碎1 min；再經(jīng)高速勻漿機(jī)以轉(zhuǎn)速12000 r/min均質(zhì)5 min（冰?。?，制成勻漿液。設(shè)立3個(gè)平行組，每組稱取50 g均質(zhì)的果漿，4 ℃，20000 r/min離心20 min，80%丙酮（4 ℃）重復(fù)提取3次，合并提取液。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至10 mL以內(nèi)，蒸餾水重溶濃縮液，定容至25 mL，分裝、-80 ℃保存。

1.4 蘋果體外模擬胃腸消化

1.4.1 模擬胃消化

參考熊云霞[12]的方法并稍作改進(jìn)。蘋果去核后取全果（含果肉和果皮）切成碎片，1000 g蘋果與1000 g 0.9% NaCl混合，經(jīng)組織攪碎機(jī)搗碎1 min，再經(jīng)高速勻漿機(jī)以轉(zhuǎn)速12000 r/min均質(zhì)5 min（冰?。?，制成勻漿液。

模擬胃液組：200 g勻漿液水浴至37 ℃后，1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=2，再加入5 mL模擬胃液（0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl）。胃酸對(duì)照組：200 g勻漿液水浴至37 ℃后，1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=2，再加入5 mL 0.01 mol/L HCl。胃空白對(duì)照組：200 g勻漿液水浴至37 ℃后，加入與模擬胃液組調(diào)節(jié)pH=2所需鹽酸等體積的0.9% NaCl，再加入5 mL 0.9% NaCl，pH為蘋果勻漿液原始pH。

實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)平行組。用錫箔紙將錐形瓶包好避光，在氮?dú)饬飨?，?7 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫水浴搖床消化，于消化的0，0.5，1，2，3 h取樣，每次取樣20 g，并將所取樣品馬上置于碎冰冷卻，經(jīng)20000 r/min離心20 min后，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 模擬腸消化

基于模擬胃消化樣品的分析結(jié)果，模擬胃消化2 h后，樣品的總多酚、總黃酮釋放量趨于平穩(wěn)（p＞0.05），因此蘋果勻漿液經(jīng)胃消化2 h后結(jié)束胃消化階段，作為腸消化0 h。

模擬腸液消化組：200 g蘋果勻漿液經(jīng)過(guò)模擬胃消化2 h后，1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，加入20 mL模擬腸液（0.3 g胰酶和1.9 g膽汁溶于60 mL 0.1 mol/L pH 7.0的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液）；腸空白對(duì)照組：200 g蘋果勻漿液經(jīng)過(guò)模擬胃消化 2 h后，1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié) pH=7，加入 20 mL的 0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液。

用錫箔紙將錐形瓶包好避光，繼續(xù)在氮?dú)饬飨轮糜?7 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫水浴搖床中，持續(xù)消化4 h，于模擬腸消化0，0.5，1，2，3，4 h取樣，每次取樣20 g，并將所取樣品置于碎冰冷卻，離心后上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 高效液相色譜條件

高效液相色譜條件在李艷等[13]的方法上稍作改進(jìn)。柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為280、320、350、370 nm；流動(dòng)相為乙腈（A）和含0.1%甲酸的超純水（B）。梯度洗脫：0～5 min，3% A；5～10 min，3%～7% A；10～25 min，7%～10% A；25～35 min，10%～12% A；35～45 min，12%～14% A；45～55 min，14%～15% A；55～65 min，15%～22% A；65～80 min，22%～25% A；80～90 min，25%～30% A；90～110 min，30%～35% A；110～115 min，35%～3% A；115～120 min，3% A。多酚單體含量測(cè)定的結(jié)果表示為mg/kg鮮重（Fresh weight，F(xiàn)W），即mg/kg FW。

1.6 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞接種在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中含有5%胎牛血清（FBS）、10 mM Hepes緩沖液、5 μg/mL胰島素、0.05 μg/mL氫化可的松、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細(xì)胞在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用 0.05%胰酶-EDTA消化傳代。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞在第10～30代之間。

1.7 蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)參考 Felice等[14]的方法并稍作改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程如下：100 μL HepG2單細(xì)胞懸液接種到96微孔透明板中（4×104個(gè)/孔），于含5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h；吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用1×PBS清洗貼壁細(xì)胞；加入100 μL不同濃度的蘋果提取物（蘋果提取物用0.22 μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌后，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋系列濃度），設(shè)空白對(duì)照組（只加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基）；于含 5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；吸出含蘋果提取物的培養(yǎng)基，1×PBS清洗貼壁細(xì)胞；每孔加入50 μL亞甲基藍(lán)溶液（含1×HBSS、1.25%戊二醛和0.6%亞甲基藍(lán)），于含5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min；吸出亞甲基藍(lán)溶液，將微孔板輕輕浸入去離子水中清洗三次至洗凈細(xì)胞表面吸附的染料。將96孔板倒置在紙巾上晾干水分后，每孔加入100 μL洗脫液（含體積分?jǐn)?shù)49% 1×PBS、50%無(wú)水乙醇、1%冰醋酸）。將96孔板室溫旋轉(zhuǎn)震蕩20 min，置于Spectra Max M5e多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定570 nm處的 OD值。若樣品組比對(duì)照組的 OD值顯著性減少（p＜0.05），即判斷為蘋果提取物有細(xì)胞毒性。

1.8 蘋果提取物抗HepG2細(xì)胞增殖活性

抗 HepG2細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)所用的蘋果提取物濃度設(shè)在沒(méi)有細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)?？乖鲋硨?shí)驗(yàn)參考Felice等[14]的方法并稍作改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程如下：100 μL HepG2單細(xì)胞懸液接種到 96微孔透明板中（2.5×104個(gè)/孔），于含 5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；吸出細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度的蘋果提取物（不同濃度提取物用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋制備），設(shè)空白對(duì)照組（只加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基）。于含 5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；吸出含蘋果提取物的培養(yǎng)基，1×PBS清洗貼壁細(xì)胞；亞甲基藍(lán)染色法測(cè)定 OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=樣品組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS V20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，平均值的差異性用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的LSD檢驗(yàn)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)平行組。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋果在模擬胃腸消化過(guò)程中多酚釋放量

蘋果分別經(jīng)過(guò)模擬胃腸消化和80%丙酮提取后，采用高效液相色譜方法測(cè)定其提取液中的多酚單體組分的釋放量。水晶富士、嘎啦果和青蘋果的多酚組分在不同提取條件下的釋放量分別見(jiàn)表1、2和3。

最大釋放量高于20 mg/kg FW的多酚組分分別為原兒茶酸（287.95±20.16 mg/kg FW）、對(duì)羥基苯甲酸（194.75±11.68 mg/kg FW）、熊果苷（102.78±6.17 mg/kg FW）、綠原酸（43.25±2.16 mg/kg FW）、沒(méi)食子酸（34.30±2.74 mg/kg FW）、維采寧-2（24.25±1.94 mg/kg FW）、芥子酸（23.70±1.42 mg/kg FW）、槲皮苷（22.86±1.37 mg/kg FW）、白藜蘆醇（20.74±1.45 mg/kg FW）。這些釋放量較大的多酚主要是羥基苯甲酸(原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸)和羥基肉桂酸（綠原酸和芥子酸）等酚酸，此外還有黃酮醇（槲皮苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、扁蓄苷）、黃酮（維采寧-2）、芪（白藜蘆醇）和熊果苷等。在水晶富士、嘎啦果和青蘋果的80%丙酮提取物中，綠原酸的釋放量最高，分別為30.72±1.54、22.37±1.12、8.70±0.44 mg/kg FW。

水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬胃消化2 h后，所測(cè)定的酚酸類物質(zhì)的釋放量顯著升高（p＜0.05），原兒 茶 酸 釋 放 量 （ 219.23±8.77 、 287.95±20.16 、247.28±9.89 mg/kg FW）分別為 80%丙酮提取物（0.19±0.02、0.58±0.05、0.65±0.07 mg/kg FW）的 1154、496、380倍，為模擬胃消化0 h（0.91±0.08、0.96±0.09、2.11±0.15 mg/kg FW）的241、300、117倍；對(duì)羥基苯甲酸釋放量（92.93±4.65、194.75±11.68、108.52±4.34 mg/kg FW）分別為 80%丙酮提取物（1.45±0.10、1.85±0.13、0.27±0.03 mg/kg FW）的64、105、402倍，為模擬胃消化 0 h（3.17±0.19、3.16±0.22、3.92±0.24 mg/kg FW）的 29、62、28倍；熊果苷釋放量（56.14±2.81、102.78±6.17、79.01±4.74 mg/kg FW）分別為 80%丙酮提取物（4.45±0.27、6.19±0.31、4.20±0.29 mg/kg FW）的13、17、19倍，為模擬胃消化 0 h（15.22±0.76、28.17±2.25、19.93±1.00 mg/kg FW）的4、4、4倍；綠原酸釋放量（30.46±1.22、43.25±2.16、22.43±1.57 mg/kg FW）分別為 80%丙酮提取物（30.72±1.5、22.37±1.12、8.70±0.44 mg/kg FW）的 1、2、3 倍，為模擬胃消化0 h（19.33±0.58、3.04±0.18、4.05±0.16 mg/kg FW）的2、14、6倍。測(cè)定的其它酚酸（沒(méi)食子酸、芥子酸）經(jīng)過(guò)模擬胃消化后，釋放量也顯著升高（p＜0.05）。這表明模擬胃消化的過(guò)程可以影響酚酸的釋放量，胃酸及胃蛋白酶的消化作用可以促進(jìn)酚酸的釋放，酚酸在酸性（pH≈2）條件下可穩(wěn)定存在。

水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬腸消化3 h后，酚酸在模擬腸消化環(huán)境下顯著降解（p＜0.05）。與模擬胃消化2 h相比，水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬腸消化3 h后，原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸釋放量均降低了 99%以上；熊果苷的降解率分別為 56%、76%和27%；綠原酸的降解率分別為49%、63%和78%；沒(méi)食子酸的降解率分別為 90%、97%和 100%；芥子酸降解率均為100%；白藜蘆醇降解率分別為74%、86%和 100%，這表明所測(cè)定的酚酸在模擬腸消化條件（pH≈7）下不穩(wěn)定，易發(fā)生降解。模擬腸消化過(guò)程也可以促進(jìn)部分多酚的釋放，水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬腸消化后釋放的槲皮苷分別是腸空白對(duì)照組的8、17和6倍；新綠原酸釋放量分別為腸空白對(duì)照組的1.5、1.9和1.0倍。在模擬腸消化過(guò)程中，釋放量顯著增加（p＜0.05）的其它多酚有：水晶富士中的異牧荊黃素、扁蓄苷、槲皮苷、柚皮素、新橙皮甙；嘎啦果中的槲皮素-3-葡萄糖苷、異牧荊黃素、柚皮甙；青蘋果中的柚皮甙。這表明，模擬腸消化的過(guò)程可以影響多酚的釋放量及其穩(wěn)定性，胰酶和膽汁可以促進(jìn)多酚的釋放，測(cè)定的大部分多酚在模擬腸消化條件（pH≈7.0）下不穩(wěn)定。

在80%丙酮提取物中測(cè)定的多酚，釋放量最大的是綠原酸。綠原酸是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，屬于羥基肉桂酸，由咖啡酸與奎尼酸縮合形成，其分子結(jié)構(gòu)含酯鍵、雙鍵、酚羥基等不穩(wěn)定化學(xué)鍵[15]。綠原酸（3-咖啡?？崴幔┙Y(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易異構(gòu)化為其它同分異構(gòu)體，如隱綠原酸（4-咖啡酰奎尼酸）和新綠原酸（5-咖啡?？崴幔?/p>

綠原酸在模擬胃消化過(guò)程中釋放量上升，在模擬腸消化過(guò)程中釋放量下降，與此同時(shí)僅在模擬腸消化過(guò)程檢測(cè)到新綠原酸。Bouayed等在蘋果的研究中也得到了相似的結(jié)果，41～77%的綠原酸在模擬腸消化過(guò)程中降解了，并在腸消化提取物中檢測(cè)到隱綠原酸和新綠原酸[16]。因此，綠原酸在模擬腸消化條件下降解，可能異構(gòu)化為新綠原酸等同分異構(gòu)體。

在80%丙酮提取物中測(cè)定的多酚，釋放量最大的是綠原酸。綠原酸是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，屬于羥基肉桂酸，由咖啡酸與奎尼酸縮合形成，其分子結(jié)構(gòu)含酯鍵、雙鍵、酚羥基等不穩(wěn)定化學(xué)鍵[15]。

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表2 H P L C 定量分析嘎啦果中的多酚釋放量（m g/k g F W）T a b l e 2 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f p o l y p h e n o l s r e l e a s e i n G a l a a p p l e b y H P L C (m g/k g F W)序號(hào)多酚8 0%酮提取物胃消化0 h胃消化2 h胃酸對(duì)照5.1 7 2 h胃空白對(duì)照2 h腸消化3 h腸空1熊果苷丙6.1 9±0.3 1 2 8.1 7±2.2 5 1 0 2.7 8±6.1 7 8 6.1 3±1 8.4 9±1.4 8 2 4.9 8±2.0 0 2 3.2沒(méi)食子酸0.1 2±0.0 1 0.8 5±0.0 8 3 3.8 2±1.6 9 2 6.7 7±1.3 4 1.4 5±0.0 9 1.0 1±0.0 8 1.0 3原兒茶酸0.5 8±0.0 5 0.9 6±0.0 9 2 8 7.9 5±2 0.1 6 2 2 3.5 9±6.7 1 0.6 1±0.0 6 2.3 1±0.1 4 0.8 4新綠原酸n d n d n d n d n d 1 1.1 6±0.7 8 6.0 5對(duì)羥基苯甲酸1.8 5±0.1 3 3.1 6±0.2 2 1 9 4.7 5±1 1.6 8 1 7 5.6 4±7.0 3 5.4 2±0.2 7 n d 6綠原酸2 2.3 7±1.1 2 3.0 4±0.1 8 4 3.2 5±2.1 6 3 5.8 0±2.1 5 4.9 2±0.2 5 1 6.1 6±0.8 1 8.6 7香草酸0.4 4±0.0 4 0.7 1±0.0 5 1.8 6±0.2 4 1.5 0±0.1 3 n d n d 0.7 8咖啡酸0.2 4±0.0 2 0.7 5±0.0 5 n d n d n d n d 9維采寧-2 2.2 5±0.1 8 5.3 1±0.4 2 2 4.2 5±1.9 4 1 5.7 9±1.4 2 1.1 7±0.0 8 n d 1 0阿魏酸n d n d 3.6 3±0.3 3 2.7 7±0.2 8 n d 3.2 6±0.2 0 2.6 1 1芥子酸n d n d 2 2.2 6±2.0 0 2 3.7 0±1.4 2 n d n d 1 2白藜蘆醇3.1 5±0.2 8 n d 2 0.7 4±1.4 5 1 6.7 1±0.6 7 2.0 5±0.1 6 2.8 3±0.1 1 1 3槲皮素-3-葡萄糖苷0.4 6±0.0 5 1.7 6±0.0 7 7.6 0±0.3 0 4.7 2±0.5 2 1.6 7±0.1 0 3.6 3±0.1 5 1 4蘆丁n d n d n d n d n d n d 1 5異牧荊黃素0.9 0±0.1 0 1 3.7 4±1.1 0 2.8 2±0.0 8 3.1 4±0.2 2 2.9 9±0.2 1 6.1 1±0.4 9 3.8 1 6新北美圣草苷n d 1.3 4±0.1 2 1.1 4±0.0 6 0.7 7±0.0 9 n d n d 1 7扁蓄苷2.5 9±0.1 6 2.2 7±0.1 1 8.5 8±0.5 2 7.5 3±0.3 8 2.3 3±0.1 6 n d 3.7 1 8槲皮苷0.1 1±0.0 1 9.6 3±0.5 8 2 2.8 6±1.3 7 1 8.8 2±1.1 3 n d 6.7 2±0.4 7 0.4 1 9柚皮素1.1 1±0.1 0 1.7 3±0.1 0 1 0.2 1±0.7 1 7.7 6±0.5 4 n d 2.5 5±0.2 3 2.1 2 0根皮苷n d n d 1 0.3 7±0.9 3 1 2.2 5±0.8 6 n d n d 2 1新橙皮甙1.9 3±0.1 5 6.5 4±0.5 2 1 1.6 5±0.5 9 8.8 6±0.8 0 n d 1.1 9±0.0 7 1.5 2 2桑色素n d n d 5.7 3±0.3 4 2.8 6±0.1 7 n d n d 2 3柚皮甙n d n d 2.4 3±0.1 2 1.2 1±0.1 0 n d 1.2 3±0.0 6 2 4根皮素n d n d 1.4 7±0.1 1 7 3 1.0 2±0.1 0 n d n d 2 5異鼠李素n d n d 1.0 6±0.1 0 0.8 5±0.1 1 0.7 1±0.1 1 n d注：n d=n o t d e t e c t e d，表示樣品在此濃度及液相參數(shù)下，儀器無(wú)法檢測(cè)到。數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3。

表3 H P L C 定量分析青蘋果中的多酚釋放量（m g/k g F W）T a b l e 3 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f p o l y p h e n o l s r e l e a s e i n G r e e n a p p l e b y H P L C (m g/k g F W)序號(hào)多酚8 0%丙酮提取物胃消化0 h胃消化2 h胃酸對(duì)照2 h胃空白對(duì)照2 h腸消化3 h腸空白1熊果苷4.2 0±0.2 9 1 9.9 3±1.0 0 7 9.0 1±4.7 4 4 0.4 5±2.4 3 1 5.5 8±0.7 8 5 7.5 0±4.0 3 4 5.1 2沒(méi)食子酸0.1 1±0.0 1 0.5 7±0.0 6 3 4.3 0±2.7 4 1 5.7 1±0.9 4 0.5 6±0.0 4 n d 3原兒茶酸0.6 5±0.0 7 2.1 1±0.1 5 2 4 7.2 8±9.8 9 9 3.6 5±4.6 8 1.6 1±0.1 0 2.4 0±0.1 2 4新綠原酸n d n d n d 1.0 2±0.0 9 n d 3.6 3±0.2 2 3.5 5對(duì)羥基苯甲酸0.2 7±0.0 3 3.9 2±0.2 4 1 0 8.5 2±4.3 4 3 7.6 8±1.1 3 8.5 7±0.3 4 n d 6綠原酸8.7 0±0.4 4 4.0 5±0.1 6 2 2.4 3±1.5 7 1 6.3 7±1.3 1 4.3 4±0.1 3 5.0 0±0.3 5 5.0 7香草酸n d n d n d n d n d 0.9 0±0.0 8 1.3 8咖啡酸n d 0.8 2±0.0 5 n d n d n d n d 9維采寧-2 0.2 6±0.0 3 8.1 6±0.4 1 1 8.2 2±1.2 8 3.4 1±0.1 7 5.9 3±0.4 2 n d 1 0阿魏酸0.3 5±0.0 3 n d n d n d 1.8 7±0.1 7 n d 1 1芥子酸0.0 6±0.0 1 0.3 2±0.0 3 7.1 5±0.5 7 7.7 5±0.5 4 0.3 4±0.0 3 n d 1 2白藜蘆醇3.0 3±0.1 5 4.2 8±0.3 4 1 5.2 6±1.2 2 8.9 2±0.3 6 n d n d 1 3槲皮素-3-葡萄糖苷1.6 1±0.1 0 3.7 9±0.2 7 5.5 4±0.3 3 8.4 9±0.6 8 2.2 2±0.1 1 4.1 1±0.2 9 1 4蘆丁n d n d 0.3 0±0.0 2 n d n d n d 1 5異牧荊黃素1.2 9±0.1 0 7.2 8±0.3 6 1.5 2±0.1 4 1.9 1±0.1 1 6.9 2±0.4 2 1.3 3±0.1 1 1.6 1 6新北美圣草苷1.0 0±0.1 0 2.5 0±0.1 2 n d n d n d n d 1 7扁蓄苷n d 3.8 1±0.2 3 2.8 8±0.1 4 3.1 0±0.1 6 n d n d 1 8槲皮苷4.1 6±0.3 7 1 1.6 4±0.8 1 5.6 0±0.2 2 6.6 1±0.6 0 0.8 9±0.0 4 5.6 7±0.2 8 0.9 1 9柚皮素0.6 1±0.0 7 1.7 7±0.1 2 5.0 6±0.3 5 2.4 6±0.0 7 1.7 4±0.1 4 2.6 3±0.1 6 2.6 2 0根皮苷0.2 4±0.0 2 0.5 2±0.0 5 0.9 2±0.0 6 0.3 5±0.0 3 n d n d 2 1新橙皮甙2.1 9±0.1 8 0.8 2±0.0 7 6.9 0±0.3 5 3.3 8±0.1 7 5.4 1±0.3 8 1.7 8±0.1 6 1.7 2 2桑色素n d 1.3 3±0.1 1 1.9 0±0.0 9 2.2 0±0.1 5 n d n d 2 3柚皮甙n d n d 2.3 4±0.1 9 1.1 0±0.0 8 n d 1.4 0±0.1 4 2 4根皮素n d n d 2.7 9±0.1 4 0.6 9±0.0 6 n d n d 2 5異鼠李素n d n d 0.9 4±0.1 0 n d n d n d注：n d=n o t d e t e c t e d，表示樣品在此濃度及液相參數(shù)下，儀器無(wú)法檢測(cè)到。數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3。

綠原酸（3-咖啡?？崴幔┙Y(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易異構(gòu)化為其它同分異構(gòu)體，如隱綠原酸（4-咖啡酰奎尼酸）和新綠原酸（5-咖啡?？崴幔?。綠原酸在模擬胃消化過(guò)程中釋放量上升，在模擬腸消化過(guò)程中釋放量下降，與此同時(shí)僅在模擬腸消化過(guò)程檢測(cè)到新綠原酸。Bouayed等在蘋果的研究中也得到了相似的結(jié)果，41～77%的綠原酸在模擬腸消化過(guò)程中降解了，并在腸消化提取物中檢測(cè)到隱綠原酸和新綠原酸[16]。因此，綠原酸在模擬腸消化條件下降解，可能異構(gòu)化為新綠原酸等同分異構(gòu)體。

模擬胃腸消化過(guò)程可以促進(jìn)多酚類物質(zhì)的釋放。模擬胃消化過(guò)程釋放量較大（大于20 mg/kg FW）的多酚為羥基苯甲酸(原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸)和羥基肉桂酸（綠原酸和芥子酸）等酚酸，此外還有黃酮（維采寧-2）、芪（白藜蘆醇）、熊果苷等。模擬腸消化過(guò)程釋放量較大的為槲皮苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、扁蓄苷（槲皮素3-α-L-阿拉伯呋喃糖苷）等黃酮醇以及新綠原酸。多酚、蛋白質(zhì)和多糖可通過(guò)非共價(jià)鍵（如疏水作用力、氫鍵和離子鍵）形成“多酚-蛋白質(zhì)-多糖”復(fù)合物，其中多酚的芳香環(huán)和蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)（如脯氨酸殘基的吡咯環(huán)）可引起疏水相互作用，蛋白質(zhì)的氫原子受體基團(tuán)和多酚的羥基之間可形成氫鍵，而離子鍵主要在蛋白質(zhì)帶正電的基團(tuán)(如精氨酸、組氨酸及賴氨酸的ε-氨基基團(tuán))和多酚帶負(fù)電的羥基基團(tuán)上產(chǎn)生[17]。在胃消化過(guò)程中，較低的pH（≈2.0）可以破壞疏水作用力以及氫鍵的形成，不利于多酚-蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物的形成，從而使得多酚從復(fù)合物中釋放出來(lái)。多酚（如綠原酸）在較高pH（≈7.0）條件下不穩(wěn)定，易被多酚氧化酶氧化形成自由基或醌類化合物[18]。

此外，消化酶（胃蛋白酶和胰酶）可以使多酚從不溶性纖維素中釋放出來(lái)[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)模擬胃腸消化過(guò)程可以促進(jìn)多酚類物質(zhì)的釋放。Tagliazucchi等在葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，模擬胃腸消化環(huán)境可以促進(jìn)多酚的釋放，在胃消化過(guò)程中總多酚、總黃酮和花青素類的釋放量增加，在腸道環(huán)境中酚酸和白藜蘆醇降解，兒茶素、槲皮素則相對(duì)較穩(wěn)定[20]。Rodríguez-Roque等發(fā)現(xiàn)，橙、菠蘿和獼猴桃模擬胃消化后綠原酸、對(duì)香豆酸、柚皮素和蘆丁的濃度升高了，阿魏酸、芥子酸、橙皮苷、槲皮素和兒茶素濃度降低，而在模擬腸條件下，大部分分析的多酚濃度降低[21]。Frontela等發(fā)現(xiàn)，菠蘿、葡萄和黑莓在模擬胃消化后，綠原酸和阿魏酸釋放量顯著增加，經(jīng)過(guò)胃腸消化后黃烷醇或原花青素可能被釋放[22]。本研究中酚酸類物質(zhì)在模擬胃消化過(guò)程中的大量釋放，可能源于較低pH條件破壞了多酚與其它物質(zhì)形成的非共價(jià)鍵以及胃蛋白酶對(duì)多酚和蛋白質(zhì)之間形成的共價(jià)鍵的消化作用，使得酚酸從“多酚-蛋白質(zhì)-多糖”復(fù)合物中釋放出來(lái)。而在腸消化過(guò)程中，黃酮醇等多酚的釋放，可能源于胰酶和膽汁的消化作用，破壞了多酚與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵（如酯鍵），從而釋放多酚。

2.2 蘋果模擬消化提取物抗 HepG2細(xì)胞增殖活性

2.2.1 蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用

水晶富士、嘎啦果和青蘋果分別經(jīng)過(guò)80%丙酮萃取以及模擬胃腸消化提取，得到的蘋果提取物配制成系列濃度，作用于人肝癌細(xì)胞HepG2，培養(yǎng)24 h后測(cè)定蘋果提取物對(duì)細(xì)胞的毒性。若樣品組比對(duì)照組的OD 值顯著性減少（p＜0.05）即判斷為蘋果提取物有細(xì)胞毒性。

蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性見(jiàn)表4。由表4可知，蘋果不同處理?xiàng)l件下的提取物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性的濃度各不相同，模擬胃消化和腸消化后的蘋果提取物產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度較低，說(shuō)明蘋果模擬胃腸消化后，其提取液對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性增強(qiáng)。我們的前期研究結(jié)果[23]表明，模擬胃腸消化后，總多酚的釋放量增高，多酚在體外條件（pH≈4）下不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解。蘋果模擬胃腸消化后，其提取物的細(xì)胞毒性增強(qiáng)，可能源于其多酚類物質(zhì)的釋放。胃空白對(duì)照組消化2 h后與胃消化0 h相比，其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度增大（即細(xì)胞毒性減弱），可能是多酚在體外條件下不穩(wěn)定發(fā)生降解引起的，這與我們前期的結(jié)果[23]相符合。

表4 蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性濃度(mg/mL)Table 4 The toxic concentration of apple extract on HepG2 cell (mg/mL)

2.2.2 蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞抗增殖活性

圖1 HepG2細(xì)胞在不同濃度的水晶富士模擬胃腸消化提取物作用下的存活率Fig.1 The survival rate of HepG2 cell intervened in different concentrations of Crystal apple simulated gastrointestinal digestion extracts

圖2 HepG2細(xì)胞在不同濃度的嘎啦果模擬胃腸消化提取物作用下的存活率Fig.2 The survival rate of HepG2 cell intervened in different concentrations of Gala apple simulated gastrointestinal digestion extracts

圖3 HepG2細(xì)胞在不同濃度的青蘋果模擬胃腸消化提取物作用下的存活率Fig.3 The survival rate of HepG2 cell intervened in different concentrations of Green apple simulated gastrointestinal digestion extracts

將系列質(zhì)量濃度的蘋果多酚提取物作用于人肝癌細(xì)胞HepG2，72 h后檢測(cè)其抗增殖活性。試驗(yàn)所用的蘋果提取物濃度均設(shè)置在沒(méi)有細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)，這樣可以確保蘋果提取物的抗HepG2細(xì)胞增殖作用不是由其本身的細(xì)胞毒性作用引起。水晶富士、嘎啦果和青蘋果不同處理?xiàng)l件下提取物作用于 HepG2細(xì)胞，細(xì)胞存活率分別如圖1、圖2及圖3所示。

不同品種、不同提取條件下，蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的作用效果不同。大部分蘋果提取物在低濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度下抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。蘋果模擬胃消化2 h及模擬腸消化3 h后的提取物在試驗(yàn)的最高濃度（分別為297、99、255 mg/mL和198、154、106 mg/mL）下可以降低HepG2細(xì)胞的存活率。在最大試驗(yàn)濃度下，水晶富士、嘎啦果及青蘋果胃消化2 h后的提取物作用于HepG2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞的存活率分別為26%、42%和44%；腸消化3 h后的提取物作用于HepG2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞的存活率分別為23%、28%和28%。這表明，水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬胃腸消化后，在最大試驗(yàn)濃度下，其提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，且模擬腸消化3 h后的提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率高于模擬胃消化2 h后的提取物。在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，蘋果模擬胃消化前（胃消化0 h）、胃酸對(duì)照組消化2 h、胃空白對(duì)照組消化2 h、腸空白組消化3 h后的提取物作用于HepG2細(xì)胞后，未降低細(xì)胞存活率（細(xì)胞生長(zhǎng)存活率＞80%），相反大部分提取物可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

水晶富士、嘎啦果和青蘋果模擬胃腸消化后，在最大試驗(yàn)濃度下，其提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，且模擬腸消化 3 h后的提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率高于模擬胃消化2 h后的提取物。大部分蘋果提取物在低濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度下抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。模擬胃腸消化后引起的抗增殖活性增強(qiáng)可能源于模擬消化可促進(jìn)多酚類物質(zhì)的釋放。有研究表明，腫瘤細(xì)胞中存在較高的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，ROS在低濃度下可作為信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，但較高的 ROS水平可以攻擊細(xì)胞的大分子物質(zhì)（如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。酚類物質(zhì)在金屬離子（如Cu2+、Fe2+）催化下可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生ROS（如·OH），引發(fā)癌細(xì)胞內(nèi)更高的氧化應(yīng)激水平，促使癌細(xì)胞DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。蘋果提取物作用于HepG2細(xì)胞后，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的水平來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖或凋亡，低濃度的蘋果提取物所含多酚的量相對(duì)較低，其產(chǎn)生的ROS水平尚不能造成細(xì)胞損傷，反而可作為信號(hào)分子促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，而高濃度的蘋果提取物所釋放多酚的量較高，可產(chǎn)生較高水平的ROS，最終損傷細(xì)胞內(nèi)的大分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。許多酚類物質(zhì)可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS的水平來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，如槲皮素可通過(guò)增強(qiáng)ROS介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[26]。此外其它多酚類物質(zhì)如白藜蘆醇[27,28]、鼠尾草酚[29]也可通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi) ROS水平誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在一定濃度范圍內(nèi)，蘋果提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖活性增強(qiáng)，原因可能在于多酚類物質(zhì)破壞了HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化-還原反應(yīng)平衡，引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平局域波動(dòng)，從而誘導(dǎo)其凋亡。多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

3.1 本研究評(píng)價(jià)了水晶富士、嘎啦果和青蘋果在模擬胃腸消化前后，多酚組分的釋放量以及其抗人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80%丙酮萃取的游離酚中，綠原酸的釋放量最高。模擬胃消化過(guò)程釋放量較大（大于20 mg/kg FW）的多酚為羥基苯甲酸(原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸)和羥基肉桂酸（綠原酸和芥子酸）等酚酸，此外還有熊果苷、白藜蘆醇和維采寧-2等。

3.2 模擬腸消化過(guò)程釋放量較大的為槲皮苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、扁蓄苷等黃酮醇以及新綠原酸。酚酸類物質(zhì)在模擬胃消化過(guò)程中的釋放，可能源于較低 pH條件破壞了多酚與其它物質(zhì)形成的非共價(jià)鍵以及胃蛋白酶水解了多酚和蛋白質(zhì)之間形成的共價(jià)鍵，使得酚酸從“多酚-蛋白質(zhì)-多糖”復(fù)合物中釋放出來(lái)。而在腸消化過(guò)程中，黃酮醇等多酚的釋放，可能源于胰酶和膽汁破壞了多酚與其它物質(zhì)之間的共價(jià)鍵（如酯鍵），使得多酚釋放出來(lái)。

3.3 蘋果提取物在低濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度下抑制其生長(zhǎng)；在一定濃度下，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，且模擬腸消化3 h后的提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的抗增殖活性最強(qiáng)。蘋果模擬胃腸消化后引起的抗增殖活性增強(qiáng)可能歸因于模擬消化促進(jìn)多酚類物質(zhì)的釋放，多酚類物質(zhì)可能破壞了HepG2細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原反應(yīng)平衡，引起細(xì)胞ROS水平局域波動(dòng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體的作用機(jī)制有待深入探討。

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