沈嬋娟，鐘永，袁朝暉，胡國(guó)瑜

(1株洲市中心醫(yī)院，湖南株洲412000；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院)

多發(fā)性骨髓瘤是一種好發(fā)于中老年的血液系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的1%，占血液系統(tǒng)腫瘤的10%～15%，近年發(fā)病率逐漸增高且發(fā)病年齡有年輕化趨勢(shì)[1]。多發(fā)性骨髓瘤自然病程為6～12個(gè)月，接受傳統(tǒng)藥物化療后中位生存期為3～5年。新的靶向藥物如蛋白酶體抑制劑硼替佐米、雷利度胺的出現(xiàn)提高了多發(fā)性骨髓瘤的臨床療效，但總體療效仍不盡人意[2]。因此迫切需要研究更有效的治療手段，如免疫治療等[3]。細(xì)胞毒性T細(xì)胞17(Tc17)是近年發(fā)現(xiàn)的一類可分泌IL-17的CD8+T細(xì)胞亞群[4]。近年研究表明Tc17細(xì)胞在小鼠體內(nèi)具有抗腫瘤效應(yīng)[5,6]，但也有文獻(xiàn)報(bào)道Tc17細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7,8]。髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細(xì)胞亞群，它可以通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在炎癥、自身免疫和移植免疫中發(fā)揮重要作用[9]。對(duì)于MDSCs與Tc17細(xì)胞比例在多發(fā)性骨髓瘤中是否有相關(guān)性尚待進(jìn)一步研究。為此，我們觀察了多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平的變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年1月～2015年12月株洲市中心醫(yī)院血液科收治的新發(fā)多發(fā)性骨髓瘤患者41例(病例組)；男25例、女16例；年齡31～78歲、中位年齡61歲；按國(guó)際分期體系(ISS)進(jìn)行分期，ISSⅠ期10例、ISSⅡ期16例、ISSⅢ期15例；不合并幽門(mén)螺桿菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等細(xì)菌病毒感染，無(wú)伴發(fā)自身免疫性疾病。選擇健康體檢志愿者19例為正常對(duì)照(對(duì)照組)，其中男12例、女7例，年齡25～60歲、中位年齡47歲。

1.2 主要試劑 PE-Cy5標(biāo)記的CD3抗體，APC標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD8抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD4、CD14抗體，PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體，PE標(biāo)記的鼠抗人CD127、HLA-DR抗體，PE標(biāo)記的IL-17抗體，同型對(duì)照APC、PE、FITC、PE-Cy5標(biāo)記的鼠IgG1免疫球蛋白均購(gòu)自eBioscience公司；細(xì)胞因子刺激劑佛波酯(PMA)和離子霉素(Ionomycin)購(gòu)于Sigma公司；細(xì)胞固定-透膜試劑盒、高爾基阻斷劑Golgistop購(gòu)自BD公司。

1.3 外周血Tc17細(xì)胞比例測(cè)算 將兩組肝素抗凝血以PBS稀釋后，用Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)整細(xì)胞密度為106/mL，鋪于平底48孔板，加入50 ng/mL的PMA、1 μg/mL的Ionomycin及Golgistop即用型高爾基體阻斷劑。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)5 h，然后取出細(xì)胞測(cè)算Tc17細(xì)胞比例。

1.4 外周血MDSCs比例測(cè)算 取刺激培養(yǎng)后的PBMC，加入CD3、CD8抗體及同型對(duì)照抗體，4 ℃避光孵育20 min，流式洗液洗滌2次，加入Fix固定液，4 ℃避光固定30 min，然后Perm/wash通透洗液洗滌2次，再加入胞內(nèi)分子IL-17A抗體及同型對(duì)照抗體，4 ℃避光孵育30 min，Perm/wash通透洗液洗滌2次后流式細(xì)胞儀測(cè)算CD3+CD8+IL-17A+細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞比例。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞密度為107/mL,吸取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管中，采用CD14、HLA-DR抗體標(biāo)記，同時(shí)標(biāo)記同型對(duì)照，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，用BD公司生產(chǎn)的Aria流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+HLA-DR-/low細(xì)胞，此即MDSCs細(xì)胞。計(jì)算MDSCs占PBMC的比例。

1.5 血漿IL-17檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血漿IL-17。試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。各項(xiàng)操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Tc17細(xì)胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平比較 病例組、對(duì)照組外周血Tc17細(xì)胞比例分別為3.06%±1.77%、0.75%±0.45%，MDSCs比例分別為6.60%±3.38%、2.53%±0.85%，血漿IL-17水平分別為(45.64±16.93)、(13.10±4.50)pg/mL，病例組外周血Tc17細(xì)胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平均高于對(duì)照組(P均<0.01)。

2.2 多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例與MDSCs比例、血漿IL-17水平的相關(guān)性 41例多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例與血漿IL-17水平無(wú)相關(guān)性(R=0.30，P>0.05)；Tc17細(xì)胞比例與MDSCs比例無(wú)相關(guān)性(R=0.160，P>0.05)。

2.3 外周血Tc17細(xì)胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例與患者性別、年齡、ISS分期、LDH水平、血肌酐水平均無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 外周血Tc17細(xì)胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

2009年，Hamada等[4]在感染流感病毒的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生IL-17的CD8+T細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞在細(xì)胞分化和細(xì)胞毒性功能上與經(jīng)典細(xì)胞毒T細(xì)胞存在差異，因此將其定義為T(mén)c17細(xì)胞。近年有許多研究報(bào)道Tc17細(xì)胞在感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[10]。有關(guān)Tc17細(xì)胞的分化調(diào)控和可塑性研究多來(lái)源于自身免疫性疾病模型，但近年也有研究報(bào)道Tc17細(xì)胞在人和小鼠腫瘤免疫中發(fā)揮作用。有學(xué)者[5]報(bào)道Tc17細(xì)胞在小鼠黑色素瘤模型中具有抗腫瘤效應(yīng)，可能和Th17細(xì)胞類似，IFN-γ可能是Tc17細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。有學(xué)者[6]將體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤抗原特異性的Tc17細(xì)胞回輸至黑色素瘤小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們可以通過(guò)募集中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞富集至腫瘤局部，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，和Tc1細(xì)胞一樣具有抗腫瘤作用。在人體腫瘤相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了Tc17細(xì)胞可能具有抗腫瘤效應(yīng)。有學(xué)者[11]報(bào)道在肺腺癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例較正常人降低，手術(shù)后患者外周血Tc17細(xì)胞比例較術(shù)前明顯增加。研究[12]報(bào)道胃癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例較正常對(duì)照明顯降低，且Tc17細(xì)胞比例與Th17細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例和絕對(duì)數(shù)較正常對(duì)照均顯著降低，同時(shí)Tc17細(xì)胞比例與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。

然而，與以上結(jié)論不同，也有研究者發(fā)現(xiàn)Tc17細(xì)胞可能具有促瘤作用：Tsai等[8]發(fā)現(xiàn)頭頸鱗癌患者外周血Tc17細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照，同時(shí)隨疾病進(jìn)展、Tc17細(xì)胞比例增加，Tc17細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例呈正相關(guān)。Zhuang等[7]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的Tc17細(xì)胞比例高于外周血、癌旁組織及正常組織，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，Tc17細(xì)胞能促進(jìn)MDSC細(xì)胞的趨化，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

早在20多年前已有學(xué)者在小鼠肺癌腫瘤模型發(fā)現(xiàn)了MDSC[14]。近年越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，MDSC在腫瘤及多種其他疾病中參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)。研究[15]報(bào)道CD11b+CD14-HLA-DR-CD33+在多發(fā)性骨髓瘤患者中可分離鑒定MDSC。腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞分泌至腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子(如TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13)、趨化因子(如CCL2、CXCL-2、CXCL12)或生長(zhǎng)因子(如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、SCF)都能誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生[16]。文獻(xiàn)報(bào)道[17]多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞可表達(dá)IL-17R，而Tc17細(xì)胞可分泌IL-17，因此我們推測(cè)在多發(fā)性骨髓瘤微環(huán)境中Tc17細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-17使多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分泌某些趨化因子，進(jìn)而募集MDSC細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤免疫的功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。

本研究結(jié)果顯示，病例組外周血Tc17細(xì)胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平均高于對(duì)照組，然而多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例與血漿IL-17水平和MDSCs比例無(wú)相關(guān)性，提示在多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)，Tc17細(xì)胞可能通過(guò)分泌產(chǎn)生其他細(xì)胞因子間接參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析Tc17細(xì)胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例與患者性別、年齡、ISS分期、LDH水平、血肌酐水平均無(wú)明顯相關(guān)性，這可能與本研究臨床樣本偏少有關(guān)，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證上述結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細(xì)胞比例、MDSCs比例及血漿IL-17水平均升高，Tc17細(xì)胞比例變化可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病有關(guān)，對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究有可能為抗腫瘤免疫治療方案的制訂提供新的理論依據(jù)。

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