張博文, 趙甲亭, 吳二威,, 李云云, 李娜, 李柏, 喬秀文, 吳剛, 高愈希,*

1. 中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所納米生物效應(yīng)及安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100049 2. 包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院, 包頭 014040 3. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石河子832003

滏陽(yáng)河是海河水系子牙河的兩大支流之一，發(fā)源于太行山東麓河北省邯鄲市的峰峰礦區(qū)滏山南麓，因此得名。滏陽(yáng)河流經(jīng)河北省邯鄲、邢臺(tái)、石家莊、衡水、滄州等地，流域包括43個(gè)縣，9 000多個(gè)鄉(xiāng)村。滏陽(yáng)河流域面積約2.28萬(wàn)km2，包括14條支流，全長(zhǎng)約402 km，總?cè)丝诔^(guò)1 500萬(wàn)。滏陽(yáng)河流域年平均氣溫13.4 ℃，年平均降水量為550 mm，主要集中在7—9月。隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，滏陽(yáng)河已成為一個(gè)典型的水資源短缺和分配不均的河流[1],也是水污染比較嚴(yán)重的流域。人們比較關(guān)注的主要污染物是 COD和氨氮[2]。由于沿途流經(jīng)許多工業(yè)城市，如河流上游的邯鄲是我國(guó)重要的冶金、電力、煤炭、建材、紡織、陶瓷、標(biāo)準(zhǔn)件生產(chǎn)基地，其鋼鐵年產(chǎn)能4 000萬(wàn)噸，新型鑄管產(chǎn)能亞洲第一，標(biāo)準(zhǔn)件產(chǎn)能占全國(guó)40%，這些產(chǎn)業(yè)的發(fā)展可能導(dǎo)致滏陽(yáng)河水體的重金屬污染[3-4]。因此對(duì)滏陽(yáng)河進(jìn)行重金屬含量檢測(cè)，并進(jìn)一步研究河流重金屬污染對(duì)水生生物的毒性尤為必要。

青?；【鶴67(Vibrio qinghaiensis sp. Q67)是朱文杰教授在青海湖所產(chǎn)的一種鯉魚體表分離得到的，是少有的淡水型發(fā)光細(xì)菌。發(fā)光菌對(duì)外界環(huán)境很敏感，當(dāng)其正常的生長(zhǎng)發(fā)光條件受到外界污染物的破壞時(shí)，它的發(fā)光強(qiáng)度就會(huì)快速改變，因此發(fā)光強(qiáng)度就是其測(cè)定周圍環(huán)境污染程度的主要參數(shù)，所以青?；【鶴67常被用作環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)。目前通常用EC50(半有效濃度)值來(lái)反應(yīng)測(cè)試樣品對(duì)環(huán)境的污染情況[5]。斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)也是一種環(huán)境檢測(cè)的模式生物，它是一種在淡水中生長(zhǎng)的藻類。斜生柵藻細(xì)胞呈紡錘狀，通常由2、4、8個(gè)細(xì)胞并排結(jié)合在一起，單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度為10～20 μm，寬度為4～9 μm，易于分離培養(yǎng)且可以直接在細(xì)胞水平上觀察，是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)材料。本研究選取了青?；【鶴67和斜生柵藻作為模式生物，檢測(cè)滏陽(yáng)河河流水體中重金屬對(duì)其產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　水樣的采集、處理和重金屬含量測(cè)定

研究主要集中在滏陽(yáng)河干流、主要支流、支流匯入地區(qū)以及排污口等地區(qū)。共設(shè)置了66個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)位置分布如圖1所示。滏陽(yáng)河表層水體樣品用有機(jī)玻璃采水器進(jìn)行采集，每個(gè)采樣點(diǎn)采集3份平行樣品，去除漂浮物。水樣用0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，濾液裝入500 mL玻璃瓶。4 ℃下密封保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

取50.0 mL水樣于250 mL的燒杯中，加硝酸1 mL，90 ℃加熱至體積小于5 mL，冷卻至室溫，用2%硝酸溶液定容至5.00 mL待測(cè)。

用Thermo公司X7型電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)在碰撞池模式下測(cè)定滏陽(yáng)河水體樣品中的金屬元素Cr、Co、Cu、Cd、Mn、Pb、Fe、Ni、Se、Hg、As、Zn等的含量。采用同心霧化器，內(nèi)標(biāo)元素為209Bi和115In。用2%的HNO3溶液梯度稀釋美國(guó)Spex Certiprep公司的含21種元素(濃度為100 mg·L-1)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，Hg的標(biāo)準(zhǔn)溶液用國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心的Hg的單元素質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)品(濃度1 000 mg·L-1)配制，相同操作條件下做各元素的工作曲線。曲線相關(guān)性系數(shù)控制在0.9999以上。

1.2　河水重金屬污染對(duì)青?；【鶴67的毒性測(cè)試

青?；【鶴67由中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心提供，配制Q67 液體培養(yǎng)基[5-6]。另外，將 4.2 mg KCl、11.1 mg CaCl2、28.6 mg MgSO4、42.0 mg NaHCO3、4.2 g NaNO3溶于1 000 mL去離子水中配成模擬湖水，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后備用。取低溫保存的Q67 菌種接種在新配制的培養(yǎng)基斜面上，22 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h，然后將菌種接入裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶?jī)?nèi)， 22 ℃恒溫振蕩(180 r·min-1)培養(yǎng)16～18 h，2 000 r·min-1下離心10 min，收集菌體，用模擬湖水將菌體制成菌懸液。調(diào)整菌懸液的密度，使其發(fā)光強(qiáng)度在200～600萬(wàn)RLU之間。以污染較嚴(yán)重的邯鄲南郊2號(hào)采樣點(diǎn)河水重金屬含量(μg·L-1): Mn(1 164.00)、Fe(57 390.00)、Zn(25 370.00)、Cu(66.27)、Cr(3 109.00)、As(49.20)、Se(4.68)、Hg(0.18)、Cd(0.64)、Pb(11.49)為依據(jù)，用模擬湖水配制重金屬污染河水，然后稀釋成100%、40%、20%、13.33%、10%、4%、2%、1%、0.2%、0.1%、0.01%系列濃度的模擬河水，加入96孔微板中，以模擬湖水為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)平行。加入菌懸液震蕩20 min后，用酶標(biāo)儀(Infinite M200，TECAN)測(cè)定各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，以空白對(duì)照的 RLU的均值(I0)和各濃度的4個(gè)平行樣的 RLU的均值(I)計(jì)算樣品對(duì)發(fā)光菌發(fā)光的相對(duì)抑制率X(%)，每塊板重復(fù)3次以減少隨機(jī)誤差。其計(jì)算公式如下：

圖1　滏陽(yáng)河水系采樣點(diǎn)分布Fig. 1　The sampling sites in Fuyang River System

X(%)=(1-I/I0)×100%

將樣品濃度 (log c, 其中c值為相對(duì)于河水重金屬含量的百分濃度)和對(duì)Q67發(fā)光菌的相對(duì)抑制率進(jìn)行回歸分析，求得相對(duì)抑制率是50%時(shí)所對(duì)應(yīng)樣品的濃度，即為模擬河水對(duì)Q67發(fā)光菌的EC50值[5-6]。

1.3　河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的毒性測(cè)試

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)藻種由中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心提供。在500 mL錐形瓶中加入200 mL藻類培養(yǎng)液BG-11(Duchefa Biochemie)，挑取平板培養(yǎng)基上的單菌落斜生柵藻藻種，在超凈臺(tái)中接種。在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照強(qiáng)度3 000 lux，光暗比12 h:12 h，每天搖動(dòng)錐形瓶3～4次，培養(yǎng)10 d左右，培養(yǎng)液呈綠色，水藻進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)的毒性測(cè)試。

以河水重金屬含量為依據(jù) (log c, 其中c為河水重金屬含量倍數(shù))，配制1 000×重金屬濃度的模擬河水，梯度稀釋成重金屬含量為0、0.1%、1%、10%、100%、10×、100×、1000×的模擬河水，取模擬河水100 mL置于250 mL錐形瓶，加對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的藻細(xì)胞懸液10 mL，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行急性毒性測(cè)試，培養(yǎng)條件與擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)相同。分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后取適量藻液測(cè)其在650 nm處的吸光值(OD值)，計(jì)算出各時(shí)間段的藻細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)抑制率。

相對(duì)生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-I/I0)×100%

其中，I0為空白對(duì)照組藻液的OD值，I為各實(shí)驗(yàn)組藻液的OD值。

河水樣品對(duì)其暴露120 h后，收集藻細(xì)胞用于相關(guān)試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

葉綠素含量的測(cè)定：取15 mL藻液，5 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，收集藻細(xì)胞，加入5 mL 80%的丙酮振蕩混勻，黑暗條件下提取24 h，10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測(cè)其在645 nm和663 nm波長(zhǎng)處的吸光值，80%的丙酮作為空白對(duì)照，葉綠素含量計(jì)算公式如下[7-8]：

C-a(葉綠素a)=12.21OD663-2.81OD645

C-b(葉綠素b)=20.13OD645-5.03 OD663

SOD酶的活性和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定：取適量藻液，5 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min收集藻細(xì)胞。加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎。將勻漿液8 500 r·min-1、4 ℃條件下離心15 min取上清液作為粗酶液用于酶的活性檢測(cè)。藻細(xì)胞中的黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色。樣品中的SOD對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，從而測(cè)出樣品中SOD酶的活力。本實(shí)驗(yàn)用購(gòu)于南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒測(cè)定SOD酶的活力，96孔板中加入20 μL藻細(xì)胞上清液，200 μL 底物溶液，20 μL黃嘌呤氧化酶工作液，37 ℃孵育20 min，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A，以20 μL純水做對(duì)照，以酶稀釋液代替酶工作液做空白。

SOD抑制率(%)=100×(A對(duì)照-A對(duì)照空白-A樣品+A樣品空白)/(A對(duì)照-A對(duì)照空白)

用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量, 用購(gòu)于南京建成生物工程研究所的MDA試劑盒按照使用說(shuō)明書測(cè)定斜生柵藻中MDA的含量。

用掃描電鏡觀察藻細(xì)胞的形態(tài)：取5 mL藻液，4 000 r·min-1離心收集藻細(xì)胞，置于2.5%戊二醛中固定6 h。0.1 mol·L-1PBS緩沖液沖洗3次。用梯度濃度的乙醇進(jìn)行脫水2次。最后用無(wú)水乙醇懸浮藻細(xì)胞制成懸液，滴加于掃描電鏡樣品臺(tái)，干燥，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運(yùn)用ANOVA方法分析實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的差異(*代表P<0.05，**代表P<0.01)，用Origin 8.0軟件繪圖。

2　結(jié)果 (Results)

2.1　滏陽(yáng)河水體重金屬污染特征

滏陽(yáng)河66個(gè)采樣點(diǎn)水體中重金屬含量如表1。表中同時(shí)給出與國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)對(duì)照得到的取樣點(diǎn)水質(zhì)分類，在GB3838—2002中鐵、錳調(diào)整為集中式生活飲用水地表水源地補(bǔ)充項(xiàng)目，這里參考了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GHZB1—1999)中規(guī)定的Fe、Mn標(biāo)準(zhǔn)值。

表1　滏陽(yáng)河各采樣點(diǎn)水體中的重金屬元素含量 (μg·L-1)Table 1　The contents of the metals in the water samples from Fuyang River System (μg·L-1)

由表1可知，全流域水體中Fe、Mn含量均比較高，有約2/3的采樣位點(diǎn)水體有較嚴(yán)重的Hg污染，主要是在滏陽(yáng)河中上游的1、2、4、6號(hào)采樣點(diǎn)，邢臺(tái)市各支流牛尾河(30)，沙河(28)，洺河(23、24)，留壘河(20、21)，北澧河(36、37、38)，午河(42、43)，石家莊市的汪洋溝(46、47、48)，洨河(44、45)，邵村排干渠(51、53)水體含汞達(dá)三類水體甚至到劣五類。滏東排河、石津總干渠、滏陽(yáng)新河水體汞含量普遍較高，近一半位點(diǎn)達(dá)劣五類水質(zhì)。只有一半左右的采樣點(diǎn)Zn、Cu、Cr含量可達(dá)到一類水體要求。Zn濃度最高位于滏陽(yáng)河邯鄲近郊的2號(hào)(25.37 mg·L-1)、邢臺(tái)段的8號(hào)、滏東排河的14、16號(hào)、邵村排干渠，滏陽(yáng)新河的60～62、64號(hào)采樣位點(diǎn)的Zn含量也超過(guò)300 μg·L-1。Cr濃度最高位于滏陽(yáng)新河的62號(hào)采樣點(diǎn)(6.23 mg·L-1)，在滏陽(yáng)河邯鄲近郊的2號(hào)、邢臺(tái)段的8號(hào)、滏東排河的14、16號(hào)、洨河、邵村排干渠(49、50、52)、石津總干渠(54)、阜陽(yáng)新河(61、64)等Cr含量也達(dá)到甚至超過(guò)了國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量V類標(biāo)準(zhǔn)。Cu濃度最高出現(xiàn)在邵村排干渠的53號(hào)采樣點(diǎn)(265.10 μg·L-1)，達(dá)到了國(guó)家地表水 II類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)采樣位點(diǎn)Pb含量達(dá)一類水體要求，Pb含量最高(43.43 μg·L-1)也位于邵村排干渠53號(hào)采樣點(diǎn)，滏東排河、石津總干渠、艾辛莊等部分位點(diǎn)Pb含量達(dá)III類水體要求。幾乎全流域As、Se(汪洋溝46、47，邵村排干渠53號(hào)采樣點(diǎn)除外)、Cd(滏東排河10號(hào)采樣點(diǎn)除外)含量可達(dá)一類水體要求。全水系有12個(gè)采樣點(diǎn)重金屬含量符合國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)的I類水體標(biāo)準(zhǔn)，包括：中游邢臺(tái)段的7號(hào)、滏東排河13號(hào)、洺河25號(hào)、沙河上游26、27號(hào)、順?biāo)?9、牛尾河33、北澧河34、35、泜河39、午河41、石津總干渠58號(hào)采樣點(diǎn)。有29個(gè)位點(diǎn)河水重金屬含量超過(guò)國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)III類水體的要求。重金屬含量較高的水體位于上游的邯鄲近郊2號(hào)、以及下游的滏東排河14、16號(hào)，位于石家莊市下游的汪洋溝47號(hào)、邵村排干渠53號(hào)、石津總干渠54號(hào)，滏陽(yáng)新河62號(hào)采樣點(diǎn)也有較高的重金屬污染。

2.2　滏陽(yáng)河水重金屬污染對(duì)青?；【鶴67的毒性

選擇金屬含量較高且具有較高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的2號(hào)采樣點(diǎn)的河水為代表，研究河流重金屬污染對(duì)水生生物的毒性。為排除河水中有機(jī)污染的干擾，根據(jù)2號(hào)采樣點(diǎn)水體的實(shí)測(cè)金屬含量配制了模擬河水，梯度稀釋，測(cè)定河流重金屬污染對(duì)青?；【亩拘浴＝Y(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　重金屬污染河水對(duì)青海弧菌Q67的劑量效應(yīng)曲線Fig. 2　Dose-response curves of heavy metals in Fuyang River to Q67

圖3　河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)抑制的劑量效應(yīng)曲線Fig. 3　Dose-response curves of heavy metals in Fuyang River to Scenedesmus obliquus growth

由圖2可知，2號(hào)采樣位點(diǎn)的河水重金屬對(duì)青海弧菌Q67有明顯毒性，隨著河水重金屬濃度的升高，毒性也隨之增強(qiáng)。2號(hào)位點(diǎn)河水濃度在4%以下時(shí)，對(duì)青?；【鶴67的發(fā)光強(qiáng)度抑制作用較弱，當(dāng)濃度達(dá)到10%及以上時(shí)，對(duì)發(fā)光菌產(chǎn)生的發(fā)光抑制率已達(dá)80%以上，2號(hào)采樣位點(diǎn)的河水對(duì)青?；【鶴67的EC50值為6.65%。屬于毒性極強(qiáng)的污染物。

2.3　滏陽(yáng)河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻的毒性

試驗(yàn)了河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可以看出：重金屬污染河水對(duì)斜生柵藻的正常生長(zhǎng)有一定的抑制作用，隨著河水重金屬濃度的增加，對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。但在最高實(shí)驗(yàn)濃度條件(河水重金屬濃度1 000倍)下，暴露4 d后生長(zhǎng)抑制率也未達(dá)到50%，河水對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制作用較弱。在河水原濃度的條件下，河水對(duì)斜生柵藻的抑制作用約為15%。提示斜生柵藻可能不適合作為評(píng)價(jià)河流重金屬污染生態(tài)危害的模式生物。

2.4　河流重金屬暴露時(shí)斜生柵藻的葉綠素含量

不同重金屬含量暴露條件下，斜生柵藻葉綠素a和葉綠素b含量見(jiàn)圖4 a和b，從圖中可見(jiàn)，隨著河水樣品濃度的提高，葉綠素a、葉綠素b的含量逐漸降低，說(shuō)明河水重金屬對(duì)斜生柵藻葉綠素合成的抑制作用也逐漸增大；河水原濃度的重金屬可以顯著降低葉綠素含量。重金屬對(duì)葉綠素a含量的影響更為明顯。

2.5　河水重金屬暴露條件下斜生柵藻的SOD活性及MDA含量

不同重金屬含量河水暴露條件下斜生柵藻的SOD活性及MDA含量見(jiàn)圖4c。從圖可見(jiàn)：在較低金屬含量(<10%)河水暴露條件下，隨河水重金屬含量增加，SOD酶活性逐漸增強(qiáng)，隨著河水金屬濃度的進(jìn)一步提高，SOD酶的活性有逐漸減弱的趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，當(dāng)河水暴露濃度為0.1%時(shí)，SOD活力單位增加0.43%；當(dāng)暴露濃度為1%時(shí)，SOD活力單位增加3.43%；當(dāng)暴露濃度為10%時(shí)，SOD活力單位增加6.86%；當(dāng)暴露濃度為100%時(shí)，SOD活力單位降低3.71%；河水金屬含量繼續(xù)增加，SOD活力持續(xù)降低，當(dāng)暴露濃度為1 000倍河水濃度時(shí)，SOD活力單位降低28.14%。

從藻細(xì)胞中MDA的含量總體趨勢(shì)來(lái)看，MDA的含量隨著河水重金屬濃度的提高隨之升高。在重金屬濃度為原河水樣品0.1%時(shí)，斜生柵藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量無(wú)顯著變化。暴露濃度增加到1%，MDA 含量有所降低，暴露濃度超過(guò)10%時(shí)， MDA的含量也顯著升高。重金屬含量為河水樣品濃度的100倍時(shí)，MDA的含量為對(duì)照組5.7倍，在本次實(shí)驗(yàn)最高暴露濃度1 000倍重金屬含量條件下，MDA含量降低為對(duì)照組的3.8倍(P<0.01)。

3　討論(Discussion)

3.1　滏陽(yáng)河水系重金屬污染特征

滏陽(yáng)河流域水體中重金屬含量相對(duì)較高的是位于邯鄲近郊2號(hào)采樣點(diǎn)，F(xiàn)e 、Zn、As含量居于各采樣點(diǎn)之首，Mn、Cr、Cu、Se、Pb也處于較高水平。其中Zn元素超出Ⅴ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)12.5倍，Cr含量也超出Ⅴ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)30倍以上。邯鄲是中國(guó)重要的鋼鐵生產(chǎn)基地，滏陽(yáng)河邯鄲近郊水體Fe、Zn、Mn、Cr較高可能與鋼鐵企業(yè)的廢水排放有關(guān)，對(duì)底泥重金屬含量分析的結(jié)果也證實(shí)，該地重金屬污染有相當(dāng)高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(數(shù)據(jù)未給出)，與郎超等[9]的結(jié)果相符。8、9號(hào)采樣點(diǎn)Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Pb、As等元素的含量都較高，該采樣區(qū)段位于艾辛莊地區(qū)，該地區(qū)有閘壩，河水流經(jīng)此地，流速減慢，水體中的重金屬元素與河流沉積物顆粒結(jié)合的較多，使重金屬元素在此地區(qū)有一定的富集，造成重金屬含量在這個(gè)區(qū)段相對(duì)較高的現(xiàn)象。洺河24、25號(hào)采樣點(diǎn)水體有較高的Fe、Mn含量，該采樣點(diǎn)位于滏陽(yáng)河永年縣境內(nèi)，當(dāng)?shù)厥侨珖?guó)知名的標(biāo)準(zhǔn)件生產(chǎn)基地[10]，標(biāo)準(zhǔn)件加工企業(yè)超過(guò)2 000家。水體中Fe、Mn含量較高可能與這些標(biāo)準(zhǔn)件加工企業(yè)的生產(chǎn)廢水排放有關(guān)。根據(jù)我們對(duì)底泥重金屬含量分析的結(jié)果。洺河22號(hào)采樣點(diǎn)有相當(dāng)高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，24號(hào)采樣點(diǎn)有很高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(數(shù)據(jù)未給出)，洨河(44、45)和汪洋溝(46～48)較高的Fe、Zn、Cu、Cr、Hg可能與接納石家莊市的生活污水和制藥廠、化工廠廢水有關(guān)[11]。底泥重金屬含量分析表明：汪洋溝46、47號(hào)采樣點(diǎn)重金屬污染有很高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(數(shù)據(jù)未給出)，49～53號(hào)采樣點(diǎn)位于邵村排干渠，除Mn、Fe、Zn含量較高外，重要的特點(diǎn)是Cr含量普遍較高，這可能與該地區(qū)較多的皮革加工廠分布有關(guān)，皮革廠的生產(chǎn)廢水、廢物中含有大量的Cr元素，該地區(qū)工廠廢水有明顯的發(fā)黑現(xiàn)象[10]。對(duì)底泥金屬含量分析的結(jié)果表明：49號(hào)采樣點(diǎn)有中等程度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，51號(hào)采樣點(diǎn)有很高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，52號(hào)采樣點(diǎn)有相當(dāng)高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。Cr可造成人體基因缺陷，引起癌癥發(fā)生，對(duì)環(huán)境有持久性危害，因此，該地區(qū)應(yīng)嚴(yán)格限制未達(dá)標(biāo)工業(yè)廢水的排放。位于石津總干渠的54～59號(hào)采樣點(diǎn)的水體中，Mn、Fe、Cu、Cr、Hg和Pb的含量相對(duì)較高。這些重金屬污染物可能主要來(lái)自于當(dāng)?shù)鼗S的污水排放。滏陽(yáng)新河的60～64號(hào)采樣點(diǎn)的Fe、Zn、Cr也較高，其中，60號(hào)采樣點(diǎn)位于艾辛莊壩閘下游，61號(hào)位于邵村排干渠接入點(diǎn)，62～64號(hào)位于衡水市下游，此河段河水補(bǔ)給主要來(lái)源于城市生活污水。底泥重金屬含量分析證實(shí)：60、61、63、66號(hào)采樣點(diǎn)有中等程度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(數(shù)據(jù)未給出)。

圖4　滏陽(yáng)河的邯鄲近郊河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻葉綠素a(a)、葉綠素b(b)、MDA(d)含量及SOD活性(c)的影響Fig. 4　Contents of chlorophyll a, chlorophyll b and MDA, and SOD activity of Scenedesmus obliquus exposed to Fuyang River System water with different heavy metals pollution levels

3.2　滏陽(yáng)河的邯鄲近郊河水對(duì)Q67的毒性

邯鄲南郊2號(hào)采樣點(diǎn)水體的重金屬污染較嚴(yán)重，2號(hào)采樣點(diǎn)底泥重金屬污染也有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，該河水樣品的主要污染元素是Fe、Zn、Cr、Mn、Cu、Pb、Hg，其中，Zn、Cr、Hg含量超過(guò)現(xiàn)行國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量V類水標(biāo)準(zhǔn)。所以，以2號(hào)采樣點(diǎn)河水為代表，研究河流重金屬污染對(duì)水生生物的毒性。由于發(fā)光菌Q67體內(nèi)的還原型黃素單核苷酸(FMNH2)分子中含有的-NH、-OH 均處在暴露的位置，而河水測(cè)試樣品中的重金屬離子易與這些基團(tuán)相結(jié)合，這些重金屬離子進(jìn)而抑制了還原型黃素單核苷酸(FMNH2)與氧化型黃素單核苷酸(FMN)2種物質(zhì)的活性，使它們之間的轉(zhuǎn)化不能正常進(jìn)行；另一方面，有文章指出，重金屬離子往往會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生氧化損傷現(xiàn)象，誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，導(dǎo)致生物體的細(xì)胞膜被破壞，生物體正常的呼吸代謝途徑也被破壞，所以發(fā)光菌的呼吸代謝受到影響，測(cè)試樣品中過(guò)量的重金屬離子導(dǎo)致發(fā)光菌的發(fā)光受到抑制。我們選取采自邯鄲市近郊的河水作為典型樣品，研究重金屬污染對(duì)模式生物Q67的毒性，該地河水重金屬含量較高，其中Fe、Zn、As含量居于各采樣點(diǎn)之首，Mn、Cr、Cu、Se、Pb也處于較高水平，所以由于重金屬污染而有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，試驗(yàn)結(jié)果證明：該河水樣品中的重金屬對(duì)青?；【鶴67的EC50值為6.65%。屬于毒性極強(qiáng)的污染物，對(duì)發(fā)光菌Q67表現(xiàn)出明顯的毒性作用。Q67可以敏感地反映出河流重金屬污染的狀態(tài)。

半最大效應(yīng)濃度時(shí)河水重金屬含量和單個(gè)重金屬EC50值列于表2，相關(guān)重金屬對(duì)Q67單獨(dú)作用時(shí)的EC50值也列于表2。

從表2可見(jiàn)，滏陽(yáng)河邯鄲近郊河水中Fe、Zn含量已經(jīng)超過(guò)了文獻(xiàn)報(bào)道的單獨(dú)作用EC50值，但金屬含量為原河水的6.65%時(shí)，各金屬含量均未超過(guò)相應(yīng)元素單獨(dú)作用時(shí)的EC50值，各種重金屬毒性效應(yīng)的疊加導(dǎo)致了河水重金屬對(duì)Q67的強(qiáng)毒性。如果將河水EC50時(shí)的金屬含量與單獨(dú)作用EC50之比衡量河水所含各重金屬對(duì)Q67毒性的貢獻(xiàn)，可知河水對(duì)Q67的毒性主要來(lái)源于Zn、Fe，其次Cr、Mn、As、Cu、Pb也有較大貢獻(xiàn)。

表2　滏陽(yáng)河2號(hào)采樣點(diǎn)河水對(duì)Q67半最大效應(yīng)濃度時(shí)河水重金屬含量(μg·L-1)和單個(gè)重金屬EC50值Table 2　EC50 of heavy metals by Q67 bioassays and heavy metal contents (μg·L-1) corresponding to EC50 of Fuyang River System (FRS) water at sampling site No.2

3.3　滏陽(yáng)河的邯鄲近郊河水對(duì)斜生柵藻的毒性

用透射電鏡觀察了不同重金屬含量河水暴露時(shí)斜生柵藻的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明：河水重金屬污染能夠改變斜生柵藻形態(tài)，空白對(duì)照組和暴露于低濃度的河水樣品的斜生柵藻細(xì)胞呈紡錘型，細(xì)胞整體較飽滿，表面結(jié)構(gòu)完整。重金屬含量相當(dāng)于河水原濃度或更高時(shí)，斜生柵藻細(xì)胞整體形狀變得狹長(zhǎng)，出現(xiàn)了畸形細(xì)胞，藻細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)完整性被破壞，細(xì)胞表面出現(xiàn)大量褶皺，細(xì)胞膜已破裂，出現(xiàn)了大量的藻細(xì)胞碎片，可能是河水重金屬對(duì)其產(chǎn)生了嚴(yán)重的氧化損傷所致。雖然河水重金屬污染對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制作用不顯著，暴露于重金屬污染較重的滏陽(yáng)河邯鄲近郊河水4 d時(shí)，對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制率也僅達(dá)到15%，但河水重金屬污染能明顯影響斜生柵藻的葉綠素、MDA含量及SOD活性。葉綠素a和葉綠素b是水藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用的2種主要色素物質(zhì)，其含量的高低會(huì)直接影響到水藻細(xì)胞正常的代謝及生長(zhǎng)。重金屬進(jìn)入藻細(xì)胞后，能與葉綠體中的蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)合，或取代了葉綠體中的Mg2+、Fe2+，從而破壞了葉綠體正常的結(jié)構(gòu)和功能，使斜生柵藻葉綠素含量降低或功能發(fā)揮受限，重金屬對(duì)葉綠素a含量的影響更為明顯，這可能與藻細(xì)胞中葉綠素a自身含量較高有一定的關(guān)系。當(dāng)重金屬含量為原河水濃度的10%時(shí)，葉綠素a含量即顯著降低，提示河流重金屬污染影響了斜生柵藻正常的生理生化活動(dòng)。很多文獻(xiàn)都用葉綠素含量來(lái)反應(yīng)植物體在環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育情況。本研究結(jié)果顯示，2種葉綠素含量隨河水樣品濃度的提高，含量逐漸降低。藻細(xì)胞中葉綠素含量可以作為評(píng)價(jià)河流重金屬污染的生態(tài)毒性的一項(xiàng)指標(biāo)。

重金屬離子可對(duì)斜生柵藻細(xì)胞造成氧化損傷，低濃度(低于所研究河水重金屬含量)的河水重金屬暴露導(dǎo)致其自身的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)被激活，SOD酶活性提高，用來(lái)抵抗外界對(duì)其產(chǎn)生的損傷作用。當(dāng)外界重金屬污染物濃度繼續(xù)增高時(shí)，超過(guò)了藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的自身調(diào)節(jié)能力，細(xì)胞受到過(guò)度的氧化損傷，正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，引起藻細(xì)胞的死亡，SOD酶的總體活性又逐漸降低，達(dá)到所研究河水重金屬含量3倍時(shí)，SOD活性顯著降低。MDA是細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生或外界刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧陰離子(·O2-)與生物膜系統(tǒng)中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)生成的醛類物質(zhì)(丙二醛)，其含量的高低也可以間接地反映出生物體受到氧化損傷的程度。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，隨著河水樣品中重金屬含量的提高，可能誘導(dǎo)和刺激斜生柵藻細(xì)胞產(chǎn)生了過(guò)量的·O2-，從而使其與膜質(zhì)中的不飽和脂肪酸反應(yīng)，在細(xì)胞中反應(yīng)生成了大量的MDA，導(dǎo)致MDA的含量上升，當(dāng)重金屬含量相當(dāng)于所研究河水的10%時(shí)。斜生柵藻體內(nèi)MDA含量即顯著上升，說(shuō)明河流重金屬污染給斜生柵藻帶來(lái)了明顯的氧化損傷。斜生柵藻MDA可以作為評(píng)估河流重金屬污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的一項(xiàng)指標(biāo)。

滏陽(yáng)河流域水體中重金屬污染較重，幾乎全部66個(gè)采樣點(diǎn)河水樣品的Fe、Mn含量都很高，2/3的采樣點(diǎn)Hg含量超過(guò)國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的V類水體要求，Cr、Zn、Pb也有較嚴(yán)重的污染，66個(gè)采樣點(diǎn)中，12個(gè)采樣點(diǎn)重金屬含量符合國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)的I類水體標(biāo)準(zhǔn)，29個(gè)采樣點(diǎn)重金屬含量超過(guò)V類水體標(biāo)準(zhǔn)。以Fe、Zn、Mn、Cr、Cu、Pb、Hg金屬含量較高的滏陽(yáng)河2號(hào)采樣點(diǎn)(邯鄲近郊)河水為典型，研究重金屬污染對(duì)發(fā)光菌Q67和斜生柵藻的毒性，發(fā)現(xiàn)河水重金屬對(duì)發(fā)光菌Q67表現(xiàn)出明顯的毒性，在重金屬含量低于河水條件下，并不會(huì)對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。但對(duì)斜生柵藻葉綠素、MDA含量和SOD酶活性有明顯影響，在重金屬含量達(dá)到河水含量的10%時(shí)，葉綠素a含量即顯著降低，MDA含量顯著升高。河水重金屬污染對(duì)水生生物有明顯毒性，在關(guān)注滏陽(yáng)河有機(jī)污染的同時(shí)，重金屬污染對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的影響也應(yīng)該給予重視。發(fā)光菌Q67的生長(zhǎng)抑制率、斜生柵藻的葉綠素a和MDA含量可以作為評(píng)估河流重金屬污染生態(tài)危害的指標(biāo)。

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