楊 俊，陳正杰，王海烽, 謝正鑫, 2，唐 俊, 2*

斜生四鏈藻對水中四環(huán)素的脅迫響應及去除作用

楊 俊1，陳正杰1，王海烽1, 謝正鑫1, 2，唐 俊1, 2*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，合肥 230036；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部合肥農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測試驗站，合肥 230036)

四環(huán)素由于其低生物降解性和水溶性而在水環(huán)境中持續(xù)存在，對生態(tài)環(huán)境安全造成較高的潛在風險。為探討水環(huán)境中殘留的四環(huán)素與藻類的相互作用，以斜生四鏈藻為研究對象，考察了斜生四鏈藻對水中不同濃度四環(huán)素（0.5、1.0、1.5、2.5、4.0和6.0 mg·L-1）的脅迫響應及去除作用。結(jié)果表明，各濃度四環(huán)素處理組均對斜生四鏈藻的生長產(chǎn)生抑制作用，最高抑制率達到了72.99%，四環(huán)素對斜生四鏈藻的半數(shù)效應質(zhì)量濃度（96 h - EC50）和抑制效應為80%質(zhì)量濃度（96 h - EC80）分別為2.46和6.9 mg·L-1。在相同濃度四環(huán)素脅迫下，斜生四鏈藻的光合色素含量和v/m值呈現(xiàn)出和斜生四鏈藻細胞密度變化相同的趨勢，與對照組相比，6.0 mg·L-1濃度處理組中斜生四鏈藻的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量在96 h的抑制率分別是87.32%、66.91%和87.58%，v/m值降幅達到了77.4%。在低、中、高濃度四環(huán)素（0.5、1.5和6.0 mg·L-1）脅迫下暴露96 h，斜生四鏈藻的丙二醛（MDA）含量整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢；超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量均受到不同程度的誘導作用，6.0 mg·L-1濃度處理組暴露96 h時，SOD活性為對照組的1.25倍，GSH含量為對照組的1.53倍。在斜生四鏈藻初始OD690值為0.15，四環(huán)素濃度為4.0 mg·L-1的條件下，48 h內(nèi)斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除率為90%，對照組的去除率為19%。研究結(jié)果為四環(huán)素對水體初級生產(chǎn)者的生態(tài)毒性提供了新資料，同時也為水體中殘留四環(huán)素的生態(tài)修復提供了新的方向。

四環(huán)素；斜生四鏈藻；急性毒性；去除作用

四環(huán)素是最常用的典型抗生素之一，被廣泛應用于動物感染治療和動物生長調(diào)節(jié)劑[1]。然而，抗生素在生物體內(nèi)通常難以代謝，相當一部分四環(huán)素（30%～90%）通過動物糞便和廢水釋放到周圍環(huán)境中[2]。由于動物糞便在農(nóng)田中的應用導致抗生素廣泛存在于多種環(huán)境介質(zhì)中，包括鄰近的地表水、沉積物、土壤和地下水[3]。受污染淡水中抗生素的濃度范圍為ng·L-1至μg·L-1[4]。在某些情況下，在生產(chǎn)設施的局部污染源中，它們的濃度可高達50 mg·L-1[5]。四環(huán)素由于其低生物降解性和水溶性而在環(huán)境中持續(xù)存在，而殘留部分由于可以刺激細菌種群中抗生素抗性基因的發(fā)展而受到廣泛關(guān)注[6]。大量研究已證實四環(huán)素對多種生物具有潛在毒性，包括浮萍[7]、藻類[8]和細菌[9]。

微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵主要組成部分，具有高生物質(zhì)生產(chǎn)力、全球分布廣泛、高增長率等特點，可作為模式生物來評價四環(huán)素在水環(huán)境中的潛在毒性[10]。迄今為止，已有研究評估了四環(huán)素對多種藻類的影響。徐冬梅等[11]研究報道了高濃度的四環(huán)素顯著增強了膜通透性并改變了藻類細胞的結(jié)構(gòu)。姜蕾等[12]研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素暴露能夠阻礙銅綠微囊藻的光合作用，破壞抗氧化酶的系統(tǒng)平衡，抑制藻類生物量的增長。董聰聰?shù)萚13]研究認為微囊藻在四環(huán)素濃度較低時，可以通過自身調(diào)節(jié)改變PSⅡ中能量配置，提高光合效率來應對四環(huán)素脅迫。還有研究報道四環(huán)素可脅迫萊茵衣藻和羊角月牙藻產(chǎn)生氧化應激反應[14-15]。

此外，有研究表明利用微藻可以有效去除廢水中的抗生素等新興污染物[16]。例如，一個高效的藻池塘（HRAP）系統(tǒng)在長達6個月的過程中，從城市廢水中去除了64種藥品及個人護理品（PPCPs），包括33種抗生素（平均濃度為223 μg·L-1），抗生素去除效率比傳統(tǒng)活性污泥法高5%～50%[17]。先前的研究還表明，微藻對污染物的去除效率主要取決于初始藻細胞密度[14]。

斜生四鏈藻作為一種常見的淡水微藻，由于其具有快速繁殖的能力以及對污染物的敏感性，已被廣泛用作水安全評價和環(huán)境毒理學檢測的模型生物[18]。雖然目前已有研究報道了四環(huán)素對其他藻類的毒性效應，但四環(huán)素的毒性機制還取決于微藻的種類。因此，本研究在分析了四環(huán)素對水環(huán)境中斜生四鏈藻生長特性（生物量、光合色素含量、葉綠素熒光、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量）影響的基礎上，進一步考察了斜生四鏈藻去除水中四環(huán)素的能力，以期為水環(huán)境中四環(huán)素的生態(tài)風險評價及污染治理提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源 斜生四鏈藻（，F(xiàn)ACHB-1810），購自中國科學院水生生物研究所，在無菌條件下，采用BG-11培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，光暗比為14 h∶10 h，光照強度為5 000 lx，每天定時搖晃培養(yǎng)瓶數(shù)次。

1.1.2 主要儀器及試劑 儀器：超高效液相色譜儀（Waters UPLC，美國沃特世科技有限公司），智能人工氣候箱（RGDF-1000C，合肥右科儀器設備有限公司），潔凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），紫外分光光度計（UV-1900i，日本島津儀器公司）。

試劑：鹽酸四環(huán)素標準品（純度>97.70%），購自上海玉博生物科技有限公司，BG11培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，甲醇、乙腈均為色譜純，購自合肥拜爾迪化學科技有限公司，其余試劑為優(yōu)級純，實驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗 為排除助溶劑對斜生四鏈藻和蛋白核小球藻生長的影響，采用超純水溶解四環(huán)素。稱取0.027 7 g 四環(huán)素，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并使用超純水進行定容，配制成500 mg·L-1的四環(huán)素母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)OECD第 201號指南（OECD 201），四環(huán)素暴露濃度梯度設置根據(jù)不同濃度四環(huán)素對斜生四鏈藻生長影響的預實驗結(jié)果分別進行適當優(yōu)化調(diào)整，四環(huán)素處理斜生四鏈藻的質(zhì)量濃度最終確定為0.5、1.0、1.5、2.5、4.0和6.0 mg·L-1，并設置只添加初始濃度為5×105cells·mL-1的空白對照組，實驗中每個處理均設置3個平行。

1.2.2 去除試驗 將處于對數(shù)生長期的斜生四鏈藻轉(zhuǎn)接入含有4.0 mg·L-1四環(huán)素的BG11培養(yǎng)基中，通過控制轉(zhuǎn)接后的三角錐形瓶中初始的OD690為 0.15來初步確定斜生四鏈藻初始添加量基本一致，并設置只添加4.0 mg·L-1四環(huán)素的BG11培養(yǎng)基為空白對照組，實驗中每個處理均設置3個平行。培養(yǎng)起始點記為第0小時，然后分別在第6、12、24、36和第48小時取樣，通過超高效液相色譜儀對培養(yǎng)基中四環(huán)素剩余濃度進行測定，利用分光光度計記錄藻液的吸光度值變化。

1.3 指標測定

1.3.1 斜生四鏈藻的藻細胞密度測定 采用光密度法[19]。取不同密度的藻液分別測定690 nm波長下藻液的吸光度值，然后在顯微鏡下用血球計數(shù)板對相應的藻細胞進行計數(shù)。以吸光度值為橫坐標、藻細胞密度為縱坐標，繪制標準曲線：

藻細胞密度（106個·mL-1）= 14.105690﹣0.067 7（1）

考慮到不同濃度的四環(huán)素在BG11培養(yǎng)基中的濁度對吸光度值測定的影響，故在計算中分別去除含有不同濃度四環(huán)素的培養(yǎng)基的吸光度值。其中，藻細胞密度增長抑制率可通過下式計算：

= (1-C/C)× 100% （2）

式中：C為處理組藻細胞密度；C為對照組藻細胞密度。

1.3.2 光合色素測定 收集暴露48 h和96 h后的藻細胞，采用熱乙醇法提取[20]，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的計算公式如下：

葉綠素a/(mg·L-1)= 16.82665+9.28652

葉綠b/(mg·L-1)= 36.92652+16.54665

類胡蘿卜素/(mg·L-1)=(1 000470–1.91C–

95.15C)/225 （3）

式中：C為葉綠素a的濃度（mg·L-1）； C為葉綠素b的濃度（mg·L-1）。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)測定 收集暴露48 h和96 h后的藻細胞，將樣品避光暗處理30 min以后檢測葉綠素熒光參數(shù)。葉綠素熒光參數(shù)使用Imaging-PAMM系列葉綠素熒光系統(tǒng)測量。光合量子產(chǎn)率值通過下式計算得到[21]：

=V/m=(m﹣0)/m（4）

式中：m為在暗適應狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖后產(chǎn)生的最大熒光值；v為在暗適應狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖前產(chǎn)生的熒光值。0為暗適應后的最小熒光值。

1.3.4 抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的測定 收集暴露48 h和96 h后的藻細胞，在冰水浴條件下，采用超聲波細胞粉碎儀超聲3 s，間隔3 s，破碎20 min（150 W），10 000 r·min-1低溫離心10 min，取上清液即為粗酶液，分別采用試劑盒（南京建成生物科技有限公司）測定粗酶液中蛋白質(zhì)含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量，以蛋白質(zhì)含量為基準對MDA、SOD和GSH進行標準化處理。

1.3.5 超高效液相色譜檢測條件 四環(huán)素的濃度采用超高效液相色譜（UPLC）（Waters, USA）法測定，配有PDA檢測器和ACQUITY UPLC BEH C18反相柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。其中，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈（色譜級），流速為 0.15 mL·min-1。四環(huán)素檢測波長λ設置為358 nm，進樣量和柱溫分別設置為10 μL和40 ℃，超高效液相色譜的梯度洗脫程序如表1所示。

表1 超高效液相色譜儀洗脫梯度

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel進行數(shù)據(jù)整理，結(jié)果為平均值±標準偏差（= 3），使用Origin 2021作圖，利用SPSS 19.0 Duncan法進行顯著性差異分析，不同小寫字母表示差異顯著，< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素對斜生四鏈藻生長的影響

藻細胞密度是一種外源化合物對藻細胞代謝產(chǎn)生抑制作用的綜合參數(shù)，通常被用來評估外源化合物對藻類的毒性[22]。由圖1(a)可知，在暴露96 h以后，0.5 mg·L-1四環(huán)素處理組中，斜生四鏈藻細胞密度與對照組相比減少了2%。6.0 mg·L-1四環(huán)素處理組中，斜生四鏈藻細胞密度與對照組相比減少了73%。由圖1(b)可知，0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素均對斜生四鏈藻的生長表現(xiàn)出抑制作用，抑制率隨著四環(huán)素濃度的增大而逐漸增加，處理第48 小時，斜生四鏈藻的生長隨四環(huán)素濃度的增加分別被抑制26.32%、37.87%、43.65%、50.06%、57.45%和59.05%；處理第96 小時，抑制率分別為1.62%、23.21%、49.06%、54.29%、59.28 %和72.99 %。經(jīng)SPSS軟件擬合可知，四環(huán)素對斜生四鏈藻的半數(shù)效應質(zhì)量濃度（96 h-EC50）和抑制效應為80%質(zhì)量濃度（96 h-EC80）分別為2.46和6.9 mg·L-1。

生長抑制率通常用作確定污染物對藻類的毒性的替代指標[23-24]。在暴露48 h以后，研究發(fā)現(xiàn)低濃度0.5～1.0 mg·L-1四環(huán)素處理對斜生四鏈藻的抑制率開始降低，這可能是因為在長期暴露后，微藻對低濃度四環(huán)素具有更強的抗性和耐受機制。其次，可能是由于斜生四鏈藻對低濃度四環(huán)素的去除作用。這兩個因素共同導致低濃度四環(huán)素對微藻生長的抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而有所降低。隨著四環(huán)素添加濃度的增大，斜生四鏈藻的生長抑制率逐漸增大，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關(guān)系。徐冬梅等[11]在四環(huán)素類抗生素對淡水綠藻的毒性作用研究中也報道了四環(huán)素對斜生四鏈藻的96 h-EC50和96 h-EC80值分別為3.27和12.87 mg·L-1，均高于本研究中的96 h-EC50和96 h-EC80值，這些差異可能是由于培養(yǎng)條件及測定指標方法的不同而導致的。

圖1 不同濃度四環(huán)素對斜生四鏈藻細胞密度（a）和抑制率（b）的影響

Figure 1 Effects of different concentrations of tetracycline on the cell density (a) and inhibition rate (b) of

圖2 不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h（a）和96 h（b）光合色素含量

Figure 2 Photosynthetic pigment contents inunder different concentrations of tetracycline at 48 h (a) and 96 h (b)

2.2 四環(huán)素對斜生四鏈藻光合色素的影響

葉綠素作為一種光合色素，對于光捕獲、能量轉(zhuǎn)移和光轉(zhuǎn)化為化學能至關(guān)重要，而類胡蘿卜素則可防止氧化應激誘導的脂質(zhì)生成，在有毒化合物的作用下，藻類的生長抑制往往與葉綠素生物合成的變化有關(guān)[20]。如圖2所示，在0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素暴露48 h和96 h后，與對照組相比，斜生四鏈藻的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量顯著降低（< 0.05）。Li等[14]也報道了類似的結(jié)果，即隨著四環(huán)素添加濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量顯著下降。由圖2可知，與對照組相比，6.0 mg·L-1四環(huán)素對斜生四鏈藻葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的抑制作用達到最大，48 h時，分別是63.12%、55.19%和60.96%；96 h時，分別是87.32%、66.91%和87.58%。光合色素含量的減少可能是由于葉綠體超微結(jié)構(gòu)和膜脂過氧化的變化所致[25-26]。據(jù)研究報道，有毒污染物可以抑制藻細胞中用于合成膽色素原的氨基乙酰丙酸脫水酶和用于合成葉綠素的原葉綠素還原酶的活性，其在葉綠素合成中起重要作用[27]。在0.5～4.0 mg·L-1四環(huán)素脅迫下，48 h斜生四鏈藻光合色素含量較96 h有所上升，這可能是由于藻類細胞具有去除葉綠體中積累的活性氧（ROS）的自我保護機制[28]。

2.3 四環(huán)素對斜生四鏈藻細胞葉綠素熒光的影響

vm值代表光合活性生物體的葉綠素熒光發(fā)射參數(shù)，它主要來源于PSⅡ的葉綠素a分子，通常被用作反映環(huán)境脅迫的指標[22]。0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素暴露培養(yǎng)48和96 h時，斜生四鏈藻的vm值（圖3）顯示，處理組與對照組有顯著性差異（< 0.05）。6.0 mg·L-1四環(huán)素處理組，48 h時斜生四鏈藻的vm值為0.079，相比對照組0.604，降幅達到了86.87%；96 h時vm值為0.149，相比對照組0.661，降幅達到了77.4%。

圖3 不同濃度四環(huán)素對斜生四鏈藻Fv/Fm參數(shù)的影響

Figure 3 Effects of different concentrations of tetracycline onv/mparameters of

圖4 不同濃度四環(huán)素對斜生四鏈藻MDA含量（a）、SOD活性（b）和GSH含量（c）的影響

Figure 4 Effects of different concentrations of tetracycline on MDA content (a), SOD activity (b) and GSH content (c) of

葉綠素熒光參數(shù)的變化能反映植物光合作用生理過程受到脅迫作出的反應，量化了光合作用的過程，使研究植物光合作用特征對毒性脅迫的表征得到深入[29]。已有研究表明，莫西沙星、加替沙星等抗生素脅迫會引起微囊藻細胞光化學量子產(chǎn)量降低[30]。本研究發(fā)現(xiàn)0.5～10.0 mg·L-1四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h和96 h時，其vm值均隨著四環(huán)素脅迫濃度的增大而顯著降低（< 0.05），表明四環(huán)素引起斜生四鏈藻細胞光合活性的損傷，損傷程度與四環(huán)素濃度呈正相關(guān)關(guān)系，這與四環(huán)素對斜生四鏈藻生長的影響結(jié)果一致。vm的下降是由于PSII反應中心失活所致，說明四環(huán)素可以作用于斜生四鏈藻細胞的PSII反應中心，并通過抑制其光合作用從而對藻細胞產(chǎn)生脅迫作用。96 h時不同濃度四環(huán)素處理組斜生四鏈藻的v/m值較48 h時均顯著上升（< 0.05），說明四環(huán)素造成的斜生四鏈藻細胞最大光化學量子產(chǎn)量的可逆性損傷，在培養(yǎng)后期有恢復趨勢。Yang等[8]的研究也觀察到了類似的現(xiàn)象，銅綠微囊藻在暴露于低濃度四環(huán)素一段時間后，其vm值可以恢復，表明銅綠微囊藻細胞的PSII反應中心對四環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性

2.4 四環(huán)素對斜生四鏈藻抗氧化系統(tǒng)的影響

活性氧具有很強的氧化性能，可以通過氧化多不飽和脂肪酸（PUFA）對細胞器造成致命的破壞。 PUFA過氧化作用會降低膜的流動性，增加滲漏并引起膜蛋白的二次損傷[31]。丙二醛（MDA）是醛類化合物，是PUFA的代表性產(chǎn)物。由圖4（a）可見，不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h時，斜生四鏈藻MDA含量顯著高于對照組（0.05），在6.5～8.0 nmol·mg-1范圍內(nèi)波動。四環(huán)素持續(xù)脅迫斜生四鏈藻96 h時，其MDA含量較48 h均有所增加，分別為48 h的1.88、1.48、1.16和1.36倍。藻細胞內(nèi)MDA含量隨著暴露時間的延長而升高表明在四環(huán)素脅迫下藻細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的形成具有時間依賴性。Liu等[32]也報道了類似的結(jié)果，即在阿莫西林和螺旋霉素暴露的前24 h內(nèi)未觀察到銅綠微囊藻細胞內(nèi)MDA含量增加 ，但隨著時間的延長逐漸增加。當暴露于土霉素時，也觀察到斜生柵藻細胞內(nèi)MDA水平升高[33]。MDA含量的增加表明四環(huán)素對斜生四鏈藻細胞造成了結(jié)構(gòu)和功能損傷。隨著四環(huán)素濃度的增加，可以觀察到藻細胞內(nèi)MDA含量整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢，同時在藻細胞內(nèi)的SOD活性和GSH含量較對照組均顯著上升（< 0.05），說明斜生四鏈藻具有提高抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量來降低藻細胞膜脂過氧化的能力。但在姜蕾等[12]的研究中，四環(huán)素暴露下銅綠微囊藻的SOD活性和POD活性均呈下降趨勢，說明銅綠微囊藻不能有效清除藻細胞內(nèi)的活性氧。這可能是因為不同微藻的氧化應激機制對四環(huán)素的響應方式之間存在著差異。

光合生物通過增加其抗氧化防御機制來抵消由細胞中積累的活性氧（ROS）誘導的抗生素的毒性。例如，超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，提供了對抗活性氧毒性和清除自由基的第一道防線。它能將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2從而阻止超氧陰離子自由基的產(chǎn)生[34]。由圖4（b）可知，0.5 mg·L-1四環(huán)素脅迫下，48 h時斜生四鏈藻的SOD活性與對照組相比，無顯著性差異（> 0.05）；1.5和6.0 mg·L-1處理組與對照組相比，有顯著性差異（< 0.05），分別是對照組的1.06和1.01倍。96 h時，斜生四鏈藻的SOD活性表現(xiàn)為應激性上升，與對照組相比，0.5～6.0 mg·L-1處理組均呈現(xiàn)出顯著性差異（< 0.05），分別是對照組的1.17、1.06和1.25倍。這些結(jié)果與先前報道的關(guān)于暴露于四環(huán)素的普通小球藻抗氧化酶活性的觀察結(jié)果一致[35]。據(jù)報道，當暴露于金霉素時，鈍頂螺旋藻細胞內(nèi)的SOD活性也顯著增加，這可能是由于藻細胞通過提高SOD活性增強消除O2和 H2O2自由基的能力[36]。有研究報道微藻細胞內(nèi)SOD催化反應產(chǎn)生過量的H2O2可能會在藻細胞中積累，從而導致藻類生長抑制[32]。

圖5 斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除率（a）和OD690值變化（b）

Figure 5 Removal rate (a) and OD690value (b) of tetracycline by

谷胱甘肽（GSH）是微藻細胞中一種重要的非酶抗氧化劑，它的主要作用是避免細胞中的重要酶被氧化，以維持細胞中正常的能量代謝[37]。由圖4(c)可知，不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h時，0.5 mg·L-1處理組與對照組相比，無顯著性差異（> 0.05）；1.5、6.0 mg·L-1處理組與對照組相比，有顯著性差異（< 0.05），分別是對照組的1.17、1.19倍。96 h時，0.5～6.0 mg·L-1處理組藻細胞內(nèi)GSH含量顯著高于對照組（0.05），在522.3～614.52 μmol·g-1范圍內(nèi)波動。結(jié)果說明斜生四鏈藻可以通過提高GSH含量消除微藻細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS并抵抗氧化應激反應。當微藻受到污染物的毒害時，細胞內(nèi)的谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)會變得活躍起來，GSH含量對于維持細胞內(nèi)谷胱甘肽還原系統(tǒng)的平衡以及清除細胞內(nèi)過量的ROS具有重要的作用[38]。類似研究表明，銅綠微囊藻在10和20 mg·L-1的頭孢拉定作用下，細胞中GSH含量顯著增加，這可能是為了消除藻體內(nèi)ROS和抵抗氧化應激的策略[39]。

2.5 斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除作用

圖5為48 h內(nèi)斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除率及OD690值變化。從四環(huán)素去除率來看，在36 h內(nèi)，斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除率較高，在36 h以后逐漸變緩。在培養(yǎng)48 h以后，斜生四鏈藻對于四環(huán)素的去除率達到了90%，對照組的去除率為19%。通過OD690值變化可以看出斜生四鏈藻在36 h時生長值達到最大值0.24，48 h時開始下降至0.22。這些結(jié)果表明，四環(huán)素對斜生四鏈藻不僅具有脅迫作用，斜生四鏈藻還具有快速、高效的去除四環(huán)素的能力。這種去除能力對于發(fā)展微藻生物技術(shù)去除抗生素類藥物具有重要意義。已有研究報道小球藻處理的合成廢水中四環(huán)素去除的主要機制是光降解和生物吸附（43 h后為92%～98%）[40]。在基于微藻和細菌的池塘中，通過間接光降解對四環(huán)素的去除率超過93%[41]。Xie等[42]在利用衣藻Tai-03去除PPCPs的研究中發(fā)現(xiàn)其可以完全去除四環(huán)素和雙酚A，其中四環(huán)素的主要去除途徑是光解和水解。Pan等[43]在利用藍藻減輕抗生素污染的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻（2 d內(nèi)去除36.7%～93.9%）和銅綠微囊藻（2 d內(nèi)去除超過98%）均具有去除四環(huán)素的潛力，且生物降解在銅綠微囊藻去除四環(huán)素的過程中占主導地位（71.6%），而蛋白核小球藻僅占20.5%。說明利用微藻去除四環(huán)素能力的差異很大程度上取決于微藻種類，但有關(guān)斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除機制還有待進一步研究。

3 結(jié)論

以斜生四鏈藻為研究對象，研究了四環(huán)素對藻細胞生長、光合色素含量、葉綠素熒光及抗氧化系統(tǒng)的影響以及斜生四鏈藻對四環(huán)素的去除作用。從所進行的實驗可以得出結(jié)論：1）不同濃度的四環(huán)素脅迫均會抑制斜生四鏈藻的光合色素含量并引起其光合活性的損傷，并抑制其生長，呈劑量-效應關(guān)系。四環(huán)素暴露96 h時，光合色素含量以及v/m值較48 h均有所上升。2）四環(huán)素脅迫導致斜生四鏈藻細胞MDA含量顯著增加，斜生四鏈藻可以通過誘導其SOD活性上升及GSH含量升高應對四環(huán)素脅迫。3）斜生四鏈藻具有快速、高效的去除四環(huán)素的能力。

[1] XIONG Y H, HOZIC D, GONCALVES A L, et al. Increasing tetracycline concentrations on the performance and communities of mixed microalgae-bacteria photo-bioreactors[J]. Algal Res, 2018, 29: 249-256.

[2] BAI L L, ZHAO Z, WANG C L, et al. Multi-spectroscopic investigation on the complexation of tetracycline with dissolved organic matter derived from algae and macrophyte[J]. Chemosphere, 2017, 187: 421-429.

[3] LIN Y, WU X, HAN Y, et al. Spatial separation of photogenerated carriers and enhanced photocatalytic performance on Ag3PO4catalysts via coupling with PPy and MWCNTs[J]. Appl Catal B Environ, 2019, 258: 117969.

[4] WANG Z, DU Y, YANG C, et al. Occurrence and ecological hazard assessment of selected antibiotics in the surface waters in and around Lake Honghu, China[J]. Sci Total Environ, 2017, 609: 1423-1432.

[5] YE J, DU Y P, WANG L M, et al. Toxin release of cyanobacteriumafter exposure to typical tetracycline antibiotic contaminants[J]. Toxins, 2017, 9(2): 53.

[6] CHEN D, CHU L B, WANG J L, et al. Degradation of antibiotic cephalosporin C in aqueous solution and elimination of antimicrobial activity by gamma irradiation[J]. Chem Eng J, 2019, 374: 1102-1108.

[7] HU H, ZHOU Q, LI X, et al. Phytoremediation of anaerobically digested swine wastewater contaminated by oxytetracycline via: nutrient removal, growth characteristics and degradation pathways[J]. Bioresour Technol, 2019, 291: 121853.

[8] YANG W W, TANG Z P, ZHOU F Q, et al. Toxicity studies of tetracycline onand[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2013, 35(2): 320-324.

[9] XU R, YANG Z H, ZHENG Y, et al. Metagenomic analysis reveals the effects of long-term antibiotic pressure on sludge anaerobic digestion and antimicrobial resistance risk[J]. Bioresour Technol, 2019, 282: 179-188.

[10] ABO B O, ODEY E A, BAKAYOKO M, et al. Microalgae to biofuels production: a review on cultivation, application and renewable energy[J]. Rev Environ Health, 2019, 34(1): 91-99.

[11] 徐冬梅, 王艷花, 饒桂維. 四環(huán)素類抗生素對淡水綠藻的毒性作用[J].環(huán)境科學, 2013, 34(9): 3386-3390.

[12] 姜蕾, 陳書怡, 尹大強. 四環(huán)素對銅綠微囊藻光合作用和抗氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報, 2010, 26(6): 564-567.

[13] 董聰聰, 張紅波, 楊燕君, 等. 四環(huán)素對微囊藻生長及光合作用的毒性效應機制[J]. 生態(tài)毒理學報, 2019, 14(6): 160-169.

[14] LI J, ZHENG X Q, LIU K C, et al. Effect of tetracycline on the growth and nutrient removal capacity ofin simulated effluent from wastewater treatment plants[J]. Bioresour Technol, 2016, 218: 1163-1169.

[15] 王雅學, 武鵬鵬, 沈洪艷. 四環(huán)素脅迫對羊角月牙藻生長及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 河北科技大學學報, 2019, 40(6): 548-554.

[16] XIONG J Q, KURADE M B, JEON B H. Can microalgae remove pharmaceutical contaminants from water? [J]. Trends Biotechnol, 2018, 36(1): 30-44.

[17] VILLAR-NAVARRO E, BAENA-NOGUERAS R M, PANIW M, et al. Removal of pharmaceuticals in urban wastewater: high rate algae pond (HRAP) based technologies as an alternative to activated sludge based processes[J]. Water Res, 2018, 139: 19-29.

[18] CAI X Y, LIU W P, SHENG G Y. Enantioselective degradation and ecotoxicity of the chiral herbicide diclofop in three freshwater alga cultures[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(6): 2139-2146.

[19] LúCIA H R R, ALEXANDRE A, MARIA T R R, et al. Algal density assessed by spectrophotometry: a calibration curve for the unicellular algae[J]. J Environ Chem Ecotoxicol, 2011, 3(8): 225-228.

[20] XIONG J Q, KURADE M B, KIM J R, et al. Ciprofloxacin toxicity and its co-metabolic removal by a freshwater microalga[J]. J Hazard Mater, 2017, 323: 212-219.

[21] YANG W F, GAO P, LI H X, et al. Mechanism of the inhibition and detoxification effects of the interaction between nanoplastics and microalgae[J]. Sci Total Environ, 2021, 783: 146919.

[22] BI Y F, MIAO S S, LU Y C, et al. Phytotoxicity, bioaccumulation and degradation of isoproturon in green algae[J]. J Hazard Mater, 2012, 243: 242-249.

[23] FAN H Y, LIU H J, DONG Y, et al. Growth inhibition and oxidative stress caused by four ionic liquids in: role of cations and anions[J]. Sci Total Environ, 2019, 651: 570-579.

[24] TUGCU G, ERTüRK M D, SA?AN M T. On the aquatic toxicity of substituted phenols to: QSTR with an extended novel data set and interspecies models[J]. J Hazard Mater, 2017, 339: 122-130.

[25] HU H, ZHOU Q, LI X, et al. Phytoremediation of anaerobically digested swine wastewater contaminated by oxytetracycline via: nutrient removal, growth characteristics and degradation pathways[J]. Bioresour Technol, 2019, 291: 121853.

[26] TONG M Y, LI X, LUO Q, et al. Effects of humic acids on biotoxicity of tetracycline to microalgaesp[J]. Algal Res, 2020, 50: 101962.

[27] PRASAD D D K, PRASAD A R K. Effect of lead and mercury on chlorophyll synthesis in mung bean seedlings[J]. Phytochemistry, 1987, 26(4): 881-883.

[28] KASAHARA M, KAGAWA T, OIKAWA K, et al. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants[J]. Nature, 2002, 420(6917): 829-832.

[29] MALLICK N, MOHN F H. Use of chlorophyll fluorescence in metal-stress research: a case study with the green microalga[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2003, 55(1): 64-69.

[30] WAN L, WU Y X, ZHANG B H, et al. Effects of moxifloxacin and gatifloxacin stress on growth, photosynthesis, antioxidant responses, and microcystin release in[J]. J Hazard Mater, 2021, 409: 124518.

[31] CHEN B, DONG J W, LI B, et al. Using a freshwater green algato evaluate the biotoxicity of ionic liquids with different cations and anions[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2020, 198: 110604.

[32] LIU Y, GUAN Y T, GAO B Y, et al. Antioxidant responses and degradation of two antibiotic contaminants in[J]. Ecotoxicol and Environ Saf, 2012, 86: 23-30.

[33] 武鵬鵬, 王雅學, 沈洪艷. 土霉素對斜生柵藻的毒性效應研究[J]. 生態(tài)毒理學報, 2020, 15(4): 215-223.

[34] ZHANG W J, CHENG C, CHEN L, et al. Enantioselective toxic effects of cyproconazole enantiomers against[J]. Chemosphere, 2016, 159: 50-57.

[35] XU D M, XIAO Y P, PAN H, et al. Toxic effects of tetracycline and its degradation products on freshwater green algae[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2019, 174: 43-47.

[36] ZHOU T, CAO L P, ZHANG Q, et al. Effect of chlortetracycline on the growth and intracellular components ofand its biodegradation pathway[J]. J Hazard Mater, 2021, 413: 125310.

[37] SMITH G A, LIN T H, SHEEHAN A E, et al. Glutathione S-transferase regulates mitochondrial populations in axons through increased glutathione oxidation[J]. Neuron, 2019, 103(1): 52-65.e6.

[38] NAVARRETE A, GONZáLEZ A, GóMEZ M, et al. Copper excess detoxification is mediated by a coordinated and complementary induction of glutathione, phytochelatins and metallothioneins in the green seaweed[J]. Plant Physiol Biochem, 2019, 135: 423-431.

[39] DU Y X, WANG J, ZHU F Y, et al. Comprehensive assessment of three typical antibiotics on cyanobacteria (): the impact and recovery capability[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2018, 160: 84-93.

[40] DE GODOS I, MU?OZ R, GUIEYSSE B. Tetracycline removal during wastewater treatment in high-rate algal ponds[J]. J Hazard Mater, 2012, 229/230: 446-449.

[41] NORVILL Z N, TOLEDO-CERVANTES A, BLANCO S, et al. Photodegradation and sorption govern tetracycline removal during wastewater treatment in algal ponds[J]. Bioresour Technol, 2017, 232: 35-43.

[42] XIE P, HO S H, PENG J, et al. Dual purpose microalgae-based biorefinery for treating pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) residues and biodiesel production[J]. Sci Total Environ, 2019, 688: 253-261.

[43] PAN M M, LYU T, ZHAN L M, et al. Mitigating antibiotic pollution using cyanobacteria: removal efficiency, pathways and metabolism[J]. Water Res, 2021, 190: 116735.

Response and remove ofto tetracycline in water

YANG Jun1, CHEN Zhengjie1, WANG Haifeng1, XIE Zhengxin1,2, TANG Jun1,2

(1. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. Hefei Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment, Ministry of Agriculture, Hefei 230036)

Tetracycline persists in the water environment due to its low biodegradability and water solubility, posing a high potential risk to ecological environment. In order to explore the toxic effect of tetracycline residual in water environment on algae, the stress response and removal effect ofto different concentrations of tetracycline (0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 4.0 and 6.0 mg·L-1) in water were investigated. The results showed that the growth ofwas inhibited at each concentration of tetracycline treatment group, with the highest inhibition rate reaching 72.99%, and the half effect mass concentration (96 h-EC50) and inhibitory effect 80% mass concentration (96 h-EC80) of tetracycline onwere 2.46 and 6.9 mg·L-1, respectively. Under the stress of the same concentration of tetracycline, the photosynthetic pigment content andv/mvalue ofshowed the same trend as the cell density of. Compared with the control group, the inhibition rates of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid content in 6.0 mg·L-1concentration group at 96 h were 87.32%, 66.91% and 87.58% respectively , and thev/mvalue decreased by 77.4%. Under the stress of low, medium and high concentrations of tetracycline (0.5, 1.5, 6.0 mg·L-1) for 96 h, the malondialdehyde (MDA) content ofshowed a trend of increasing first and then decreasing; the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of glutathione (GSH) were induced in different degrees. After exposure for 96 h, the activity of SOD and the content of GSH in the 6.0 mg·L-1group were 1.25 and 1.53 times higher than those in the control group. When the initial OD690value ofwas 0.15 and the concentration of tetracycline was 4.0 mg·L-1, the removal rate of tetracycline byreached 90% within 48 h, while that of the control group was 19%. These studies provide some new information on the ecotoxicity of tetracycline to primary producers in water, and also provide a new direction for the ecological remediation of residual tetracycline in water.

tetracycline;; acute toxicity; removal effect

X171.5; X52

A

1672-352X (2023)02-0289-08

2022-05-12

國家自然科學基金（51609001，51709002）資助。

楊 俊，碩士研究生。E-mail：anhuinongye@163.com

通信作者:唐 俊，博士，副教授。E-mail：tangjun@ahau.edu.cn

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.019

2023-05-12 10:26:03

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20230511.1337.038.html