吳鳳筍 ， 呂玉金 ， 劉玲玲 ， 趙 迪 ， 李文剛

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PPV)引起的一種豬繁殖障礙性疾病，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎。該病在世界許多國(guó)家和地區(qū)都有不同程度的發(fā)生和流行，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1]。因此，建立一種敏感、快速、準(zhǔn)確的豬細(xì)小病毒檢測(cè)方法就尤為重要。

本研究將熒光標(biāo)記的豬細(xì)小病毒VP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于基因芯片上的探針進(jìn)行雜交制作基因檢測(cè)芯片，以達(dá)到能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)到豬細(xì)小病毒，為生產(chǎn)實(shí)踐提供一種檢出率高的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 分離毒株 豬細(xì)小病毒分離毒株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏占勇教授惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器及設(shè)備 基因芯片點(diǎn)樣儀(美國(guó)Bio-Dot公司)；Innoscan700型基因芯片掃描儀(法國(guó)Innopsys公司)；PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)； DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon 2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

基因芯片點(diǎn)樣液、雜交液、醛基基片、芯片雜交盒(博奧生物集團(tuán)有限公司)；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；5× 電泳儲(chǔ)存液(5×TBE)、洗脫液1、2、3等均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院豬病防控中心實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 基因組DNA的提取 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，在PK-15細(xì)胞上增殖病毒，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取豬細(xì)小病毒DNA模板。

1.4 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)，以豬細(xì)小病毒(GenBank序列號(hào)為：NC-001718)VP2蛋白的基因序列為靶序列，利用Primer Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針。

上游引物：5′-CAAACAGATCTCTAGGACTGC-3′；

下游引物：5′-Cy3-GTGGTTAAGTGTCCATGTTGG-3′；

探針：5′-NH2-TTTTTTTT-CAGCAATTAGGCCAGCTC-3′。

在下游5′端進(jìn)行Cy3熒光標(biāo)記，探針的5′端氨基化修飾，并在氨基和探針之間加上8個(gè)T。特異性引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。用TE Buffer稀釋成10 μmol/L的濃度，置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因芯片的制備 首先，使用TE Buffer將合成的PPV的凍干探針稀釋成100 μmol/L的母液，最終稀釋成5 μmol/L(5 μL探針+45 μL滅菌水+50 μL點(diǎn)樣緩沖液)。然后，在96孔U形板的A孔加入100 μL點(diǎn)樣緩沖液作陰性對(duì)照，B孔加入100 μL含熒光的PCR產(chǎn)物作陽(yáng)性對(duì)照，C孔加入100 μL 5μmol/L的探針。最后，按照基因芯片點(diǎn)樣儀預(yù)定程序?qū)θ┗M(jìn)行噴點(diǎn)式點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境：相對(duì)濕度55%～65%，溫度20 ℃～30 ℃；點(diǎn)樣陣列：設(shè)定為六矩陣，每個(gè)矩陣內(nèi)點(diǎn)樣為5×3；探針固定：利用盛有探針固定增效劑的濕盒存放點(diǎn)樣完畢的芯片，置于烘箱固定備用。芯片點(diǎn)樣方式見(jiàn)圖1。

圖1 芯片點(diǎn)樣陣列示意圖A:陰性對(duì)照 ； B:陽(yáng)性對(duì)照 ； C:濃度為5 μmol/L探針

1.6 雜交用PCR產(chǎn)物的制備與鑒定 雜交用產(chǎn)物選擇不對(duì)稱PCR，反應(yīng)總體積為25 μL，其組成為：5×Buffer 5.0 μL、dNTP(10 mmoL/μL) 2.0 μL、上游引物(10 μmol/L)1.0 μL、下游引物(10 μmol/L)2.0 μL、模板DNA1.0μL、Prime STAR 0.3 μL、ddH2O 13.7 μL。除下游引物外其他成分充分混合后在暗室中加入下游引物，混勻后于PCR儀內(nèi)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳并用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察拍照。

1.7 基因芯片的雜交 將PCR產(chǎn)物在PCR儀內(nèi)98 ℃變性10 min，取出后立即冰浴5 min，取該變性產(chǎn)物和雜交緩沖液按1∶4(40 μL PCR產(chǎn)物與160 μL雜交緩沖液混合)的比例在離心管中混勻。將芯片放入雜交盒內(nèi)，再將上述混合液體加到芯片的點(diǎn)樣區(qū)，最后置于47 ℃恒溫箱中進(jìn)行避光雜交1 h。用50 ℃預(yù)熱的洗液1、2、3對(duì)完成雜交的芯片在暗室內(nèi)各洗滌2 min，離心干燥后掃描分析。

1.8 臨床樣品的檢測(cè) 利用建立的基因芯片方法對(duì)20份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，然后使用同樣的特異性引物對(duì)樣品中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)以及陽(yáng)性樣本的 PCR 產(chǎn)物DNA 測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，并將兩者結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不對(duì)稱PCR擴(kuò)增結(jié)果與分析 以PPV基因組DNA為模板，與特異性引物進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)擴(kuò)增片段與預(yù)期目的片段一致。

圖2 不對(duì)稱PCR電泳圖

2.2 PPV基因芯片掃描結(jié)果與分析 將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在芯片上的探針進(jìn)行雜交，掃描雜交結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 PPV檢測(cè)芯片雜交掃描結(jié)果

2.3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 用建立的基因芯片檢測(cè)方法與PCR方法同時(shí)應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明，兩個(gè)結(jié)果的符合率達(dá)100%。其中20份樣品中，豬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣品為1份。這與豬場(chǎng)接種疫苗有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

3.1 基因芯片檢測(cè)技術(shù) 對(duì)于豬病感染，傳統(tǒng)的病原分離鑒定和血清學(xué)方法等對(duì)病毒性疫病的診斷存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差等不足，而基因芯片技術(shù)是集分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及標(biāo)記于一體的基因分析技術(shù)[2]，該技術(shù)是同時(shí)將大量的探針?lè)肿庸潭ǖ焦滔嘀С治锷?，借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析。

基因芯片技術(shù)自應(yīng)用于病原的診斷后，其所具有的靈敏、特異及高通量特點(diǎn)彌補(bǔ)了其他檢測(cè)方法的不足，可以通過(guò)建立基因芯片探針，在一個(gè)平臺(tái)上、一次檢測(cè)中對(duì)大量的樣品進(jìn)行病原診斷，利于對(duì)疾病作出快速、準(zhǔn)確的診斷，適合大量臨床病料中病原體的快速檢測(cè)。且具有并行性，即在同一反應(yīng)條件下，可有效地避免了誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的可信度；自動(dòng)化，利用計(jì)算機(jī)完成制備過(guò)程及獲取結(jié)果，避免人工誤判，結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確[3,4]。

3.2 不對(duì)稱PCR的應(yīng)用 本研究采用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增目的基因，因雙鏈DNA與基因芯片探針結(jié)合，大部分為兩條鏈之間的自身無(wú)效雜交，將影響到檢測(cè)結(jié)果，而單鏈DNA更易與探針結(jié)合，其雜交效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雙鏈DNA，靈敏度也更好[4]。因此，芯片雜交時(shí)需獲得足夠量的單鏈DNA，而不對(duì)稱PCR就是一個(gè)有效的途徑。本試驗(yàn)利用不對(duì)稱PCR方法來(lái)獲取單鏈DNA，為了保證在雜交過(guò)程中有大量的核酸參與，通過(guò)控制上下游引物(下游引物進(jìn)行熒光標(biāo)記)的比例來(lái)保證單鏈DNA的獲取量，試驗(yàn)結(jié)果表明，上下游引物的濃度采用1∶2的比例可以獲得較好的雜交信號(hào)。

3.3 目的基因的標(biāo)記和探針的修飾 本研究目的基因的標(biāo)記采用PCR擴(kuò)增標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是在完成對(duì)目的基因特異性擴(kuò)增的同時(shí)也完成了對(duì)目的基因的熒光標(biāo)記，提高檢測(cè)的靈敏度[5]。芯片雜交是游離的靶序列與固定在玻片上的探針結(jié)合的過(guò)程，探針與玻片的距離過(guò)小會(huì)增大雜交時(shí)的空間位阻，會(huì)使靶序列與探針不易結(jié)合。因此，在探針的5′端加上8個(gè)PoLy(dT)，增加一定長(zhǎng)度的間隔臂PoLy(dT)，減小空間位阻，利于芯片的雜交[6-7]。且在寡核苷酸芯片的制備過(guò)程中，可根據(jù)寡核苷酸探針的長(zhǎng)短來(lái)選擇功能化基片，一般來(lái)說(shuō)，氨基化玻片或多聚賴氨酸(PLL)玻片適用于較長(zhǎng)的探針(長(zhǎng)度超過(guò)50 mer)，較短的寡核苷酸探針選擇醛基化玻片。本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的探針長(zhǎng)度為18 mer，所以選用醛基化玻片，在探針合成時(shí)5′均需要氨基化修飾，便于探針在醛基基片上的固定。

本研究制備的豬細(xì)小病毒檢測(cè)基因芯片，可成功地檢測(cè)到豬細(xì)小病毒VP2基因，且重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、敏感性高，其中敏感性可達(dá)34.5 ng/μL，比PCR檢測(cè)的靈敏性更高，是一種簡(jiǎn)便、快速的診斷方法，在生產(chǎn)實(shí)踐中有很高的應(yīng)用價(jià)值[8]。

本研究通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的反復(fù)摸索，采用濃度為5 μmol/L的探針與PCR產(chǎn)物雜交1 h即可得到清晰的熒光信號(hào)，采用較低濃度的探針降低了成本。本研究將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)，解決了疫病檢測(cè)中的難題，具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[9]。該方法也為其他病原應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)提供了理論基礎(chǔ)。

對(duì)于危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的疫病的快速診斷是控制該病的重要前提，而傳統(tǒng)的生物學(xué)方法存在著費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性低、操作復(fù)雜等不足，而基因芯片有所具有的高特異性、高通量、高敏感性可彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，但是傳統(tǒng)的芯片平臺(tái)因依賴于熒光標(biāo)記技術(shù)，需要昂貴的掃描設(shè)備進(jìn)行掃描以及操作過(guò)程復(fù)雜，對(duì)技術(shù)要求較高，難以做到基層推廣。因此，需要進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，來(lái)促進(jìn)診斷用基因芯片的商品化，實(shí)現(xiàn)在規(guī)模豬場(chǎng)常見(jiàn)傳染病的鑒別診斷中的應(yīng)用常態(tài)化。

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